張曲玲， 楊占南， 羅世瓊， 霍鴻浩， 趙 鋮， 扶 蝶， 楊 娟

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001； 2.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550001；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽 550001)

黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)廣泛分布于我國及世界各地，是傳統(tǒng)的藥用植物，富含萜類、酚類、類黃酮及其他代謝物，民間用于治療多種疾病，如抗瘧疾、抗炎、止血等[1-3]。研究顯示，黃花蒿還具有其他藥效功能，如具有抗癌細(xì)胞活性[4]以及抑制艾滋病毒的作用[5]。黃花蒿是青蒿素的唯一原料來源，因此，我國特別是西南部重慶等地將黃花蒿作為重要的主要經(jīng)濟(jì)作物[6-7]。但因?yàn)樗鼘?duì)環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性，且耐貧瘠，往往是裸露新地的先鋒植物[8]，大面積栽培或大量聚集生長(zhǎng)會(huì)對(duì)周圍植物或當(dāng)季及后茬作物產(chǎn)生化感效應(yīng)[9-12]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)受黃花蒿化感影響的植物有燕麥、小麥、蒲公英、黃瓜、蘿卜[13]、豇豆、菜豆、白菜、大白菜[9]、灰菜、玉米、豌豆[14]、綠豆[15]、綠藻[16]等。但鮮見黃花蒿對(duì)赤豆化感作用的報(bào)道。

赤豆[Vignaangularis(Willd.) Ohwi et Ohash]別稱小豆或赤小豆，含有蛋白質(zhì)、糖類、粗纖維、鈣、磷等營養(yǎng)成分，是一種很受歡迎的大眾食品[17]。赤豆植株成直立或纏繞草本生長(zhǎng)，花期在夏季，每年的9月—10月結(jié)果，全國均有栽種，西南地區(qū)往往種植于田邊和地邊，且與黃花蒿是同季作物[18]。而黃花蒿是一種強(qiáng)侵染性植物，喜長(zhǎng)于田間地頭，可能對(duì)其周圍赤豆種子萌發(fā)及生長(zhǎng)造成影響[1]。因此，研究黃花蒿對(duì)赤豆化感效應(yīng)具有重要意義。本研究以赤豆為受試對(duì)象，通過室內(nèi)培養(yǎng)，研究各部位不同濃度黃花蒿水浸液(aqueous extracts from Aremisia annus. L，簡(jiǎn)稱AEA)對(duì)赤豆種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、保護(hù)酶活性、丙二醛和葉綠素含量的化感效應(yīng)，為明確黃花蒿對(duì)赤豆生長(zhǎng)的機(jī)制及制定有效防范措施提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試赤豆于2017年7月6日購買于貴州省貴陽市萬東橋農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。供試黃花蒿于2016年8月26日采集于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)周邊山坡上，洗凈根部，將根、莖、葉分開，自然風(fēng)干，經(jīng)粉碎，過100目篩，分別裝入樣品袋備用。于2017年10月在貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行化感效應(yīng)試驗(yàn)。

1.2 水浸液的制備

稱取備好的黃花蒿粉末10 g，置于裝有100 mL去離子水的250 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為141 r/min，溫度為25 ℃的振蕩器中浸泡24 h。取出后，4 000 r/min離心10 min，取上清液得含有原料濃度為100 mg/mL的AEA，放入4 ℃冰箱中保存。使用前取出，并用去離子水配制成0(CK)、10、20、30、40 mg/mL 的濃度。

1.3 試驗(yàn)處理

選取顆粒飽滿、大小一致的赤豆種子，用1.0%過氧化氫溶液(H2O2)消毒1 min，無菌去離子水洗凈。分別置于鋪有雙層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻放置30粒消毒處理的赤豆，再加入10 mL各濃度AEA，各部位AEA的每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，以等量的去離子水為對(duì)照(即濃度 0 mg/mL，CK)，共42個(gè)重復(fù)。加蓋并在25 ℃暗培養(yǎng)，第3天記錄最終發(fā)芽數(shù)，幼苗持續(xù)培養(yǎng)15 d，自然光照，赤豆生長(zhǎng)情況見圖1。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

以芽長(zhǎng)超過種子的1/2為標(biāo)準(zhǔn)記錄種子是否萌發(fā)，且以萌發(fā)的種子能生長(zhǎng)成幼苗，計(jì)算赤豆種子的萌發(fā)率。在赤豆幼苗培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，測(cè)量幼苗的莖長(zhǎng)，單位是cm；稱10株長(zhǎng)勢(shì)均勻幼苗的鮮質(zhì)量，單位是g/10株；并分析幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性，過氧化物酶(POD)活性，丙二醛(MDA)含量及葉綠素含量。SOD、POD活性及MDA含量分別采用愈創(chuàng)木酚、氮藍(lán)四唑和硫代巴比妥酸比色法測(cè)定；葉綠素含量使用分光光度法測(cè)定[19]

1.5 數(shù)據(jù)處理

赤豆種子萌發(fā)率=(萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；赤豆種子萌發(fā)抑制率=[(對(duì)照種子萌發(fā)率-處理種子萌發(fā)率)/對(duì)照種子萌發(fā)率]×100%。參照Williamson的方法[20]計(jì)算AEA的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)。即：RI=1-C/T；式中，C為對(duì)照值，T為處理值；RI>0為促進(jìn)作用，RI<0為抑制作用，負(fù)值越小或負(fù)值的絕對(duì)值越大，化感效應(yīng)越強(qiáng)。通過此公式，可以計(jì)算出黃花蒿水浸葉對(duì)赤豆幼苗莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量的RI。用Excel進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)和作圖；采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤差分析、單因素方差分析和LSD法(最小顯著性差異法)作顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P﹤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEA對(duì)赤豆萌發(fā)的影響

由圖2可知，AEA對(duì)赤豆萌發(fā)的影響具有來源(根、莖、葉)和濃度差異。與對(duì)照相比，除根AEA處理濃度為 10 mg/mL 時(shí)，赤豆種子的萌發(fā)率略有提高外，其他各處理均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。10 mg/mL根、莖、葉AEA處理種子，赤豆的萌發(fā)率分別為95.71%、87.62%、81.90%；40 mg/mL根、莖、葉AEA處理種子的萌發(fā)率分別為87.62%、80.00%、73.33%。各部位AEA對(duì)赤豆種子萌發(fā)抑制作用強(qiáng)弱依次為根<莖<葉，10 mg/mL根、莖、葉AEA對(duì)赤豆萌發(fā)抑制率分別為-0.75%、7.77%、13.78%；40 mg/mL根、莖、葉AEA處理的萌發(fā)抑制率分別為7.77%、15.79%、22.81%。

2.2 AEA對(duì)赤豆幼苗生長(zhǎng)的影響

圖3為AEA對(duì)赤豆幼苗生長(zhǎng)情況的影響，葉AEA處理后的赤豆幼苗植株明顯矮化，幼苗葉片和根系畸形。各部位不同濃度處理的幼苗，培養(yǎng)期間莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。根AEA對(duì)赤豆幼苗的生長(zhǎng)影響不大，濃度為 10 mg/mL 時(shí)，對(duì)幼苗莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量還有一定的促進(jìn)作用，與對(duì)照相比，幼苗莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量分別增加3.94 cm、0.70 g/10株，濃度20～40 mg/mL AEA處理的幼苗生長(zhǎng)狀況平穩(wěn)，影響不大。莖AEA處理后的幼苗，隨處理濃度增加，莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)緩慢減小的趨勢(shì)。但葉AEA對(duì)赤豆幼苗的影響更明顯，隨處理濃度增加，幼苗的莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量均表現(xiàn)出明顯下降的趨勢(shì)，與對(duì)照相比，10、20、30、40 mg/mL葉AEA處理的幼苗莖長(zhǎng)分別降低29.46%、38.13%、48.07%、68.25%，鮮質(zhì)量分別下降20.08%、27.37%、48.57%、68.67%。值得注意的是，AEA對(duì)赤豆幼苗生長(zhǎng)的影響因水浸液來源黃花蒿部位的不同而異，與萌發(fā)率相似，影響強(qiáng)弱趨勢(shì)為根<莖<葉。處理濃度達(dá)40 mg/mL時(shí)，幼苗莖長(zhǎng)分別為 22.12、17.02、7.22 cm；鮮質(zhì)量分別為3.26、3.06、1.85 g/10株?？梢婞S花蒿對(duì)赤豆幼苗生長(zhǎng)有抑制作用的化感成分主要存在于葉片。

利用赤豆幼苗的莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量進(jìn)行分析，得到不同濃度AEA的IR。由表1可知，黃花蒿不同部位、不同濃度AEA，除濃度為10、20 mg/mL根AEA對(duì)幼苗的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用外，其他各AEA處理濃度均有不同程度的抑制效應(yīng)，且隨AEA濃度增加，IR值越小，說明對(duì)赤豆幼苗的化感效應(yīng)增強(qiáng)。各部位AEA處理濃度，除根30和40 mg/mL處理的莖長(zhǎng)RI、根和莖20和30 mg/mL處理的鮮質(zhì)量RI之間不顯著以外，其余各濃度之間差異均顯著。但赤豆幼苗對(duì)不同部位AEA化感效應(yīng)的響應(yīng)不同，從綜合效應(yīng)指數(shù)來看，表現(xiàn)為根AEA化感作用較小，其次是莖，最大為葉片。

表1 AEA對(duì)赤豆幼苗生長(zhǎng)的化感效應(yīng)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 AEA對(duì)赤豆幼苗生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1 AEA對(duì)保護(hù)酶活性的影響 由圖4可知，黃花蒿各部位AEA隨濃度升高，SOD活性降低，但降低的幅度不盡相同，根和莖AEA各濃度處理降低的幅度小，葉AEA各濃度處理降低的幅度大，與對(duì)照相比，10、20、40 mg/mL根、莖、葉AEA處理下的SOD分別降低0.76、1.51、1.87、2.11 U/g(根)；1.81、2.33、3.32、3.30 U/g(莖)；6.13、7.48、7.86、8.88 U/g(葉)。根AEA除了40 mg/mL的SOD活性顯著低于對(duì)照外，其他各處理濃度之間沒有顯著性差異；莖部AEA除了10 mg/mL處理的SOD活性與對(duì)照沒有顯著性差異外，其他3個(gè)濃度都顯著低于對(duì)照，且它們之間沒有顯著性差異；葉片AEA各處理濃度之間，除了20和 30 mg/mL 外，均差異顯著。與SOD活性相反，POD活性除根AEA處理濃度為 10 mg/mL 時(shí)比對(duì)照顯著下降外，總體隨著處理濃度的升高而增大。但增加的幅度各有差異，根10、20、30 mg/mL的AEA與對(duì)照相比無顯著性增加，當(dāng)升高到40 mg/mL時(shí)，POD活性顯著大幅度增加； 莖部AEA各濃度， 除了10 mg/mL的AEA與對(duì)照的POD活性無顯著性增加外，其余各濃度均顯著提高；葉片各濃度AEA處理下的POD活性均顯著高于對(duì)照，說明葉片在低濃度時(shí)均會(huì)對(duì)POD活性造成負(fù)面影響。

2.3.2 AEA對(duì)赤豆幼苗MDA及葉綠素含量的影響 由圖5可看出，MDA含量隨著AEA濃度增加而升高。葉片AEA對(duì)MDA的累積促進(jìn)作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)，MDA含量最高，為7.69 mmol/g，是對(duì)照的2.30倍；其次是莖部AEA處理，與葉片AEA處理的MDA含量差異大，與根部AEA差異小，40 mg/mL時(shí)，MDA含量為4.91 mmol/g，為對(duì)照的1.46倍。根AEA對(duì)MDA含量的影響最弱，位于折線圖的最下方，各濃度與對(duì)照的差異不大，AEA濃度為 40 mg/mL 時(shí)，MDA含量最高，為對(duì)照的1.15倍。

AEA對(duì)赤豆幼苗總?cè)~綠素含量的影響因來源部位不同而異，葉片AEA濃度在10、20 mg/mL時(shí)葉綠素含量升高，分別比對(duì)照顯著提高15.30%、13.55%；30、40 mg/mL時(shí)葉綠素含量降低，與對(duì)照無顯著性差異。莖部AEA處理的幼苗，葉綠素含量變化不大，但總體高于葉片，并且都顯著高于對(duì)照，10、20、30、40 mg/mL莖部AEA分別比對(duì)照提高 19.26%、16.67%、23.54%、14.58%。根AEA處理濃度在10、20 mg/mL 時(shí)葉綠素含量比對(duì)照分別降低3.20%、8.88%，30、40 mg/mL 時(shí)葉綠素含量分別顯著升高10.88%、20.36%，在 40 mg/mL 時(shí)葉綠素含量最高，為10.04 mg/g。

3 結(jié)論與討論

植物界普遍存在化感效應(yīng)，其化感成分會(huì)抑制周圍其他植物的生長(zhǎng)，利于擴(kuò)大自身的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[21]。白三葉水浸液影響無芒稗種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[22]，黃連須根浸提液降低萵苣、綠豆和白菜種子的活力指數(shù)，并顯著降低這些植物幼苗的生物量和根系活力[23]。黃花蒿在生長(zhǎng)過程中，不僅影響植物的生長(zhǎng)，還影響其土壤微生物和動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖[14]。近期趙鋮等報(bào)道了AEA對(duì)同季作物綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用[15]，本研究探討了AEA對(duì)赤豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的化感效應(yīng)。結(jié)果顯示，黃花蒿各部位不同濃度AEA對(duì)赤豆種子萌發(fā)的化感作用，除了根AEA為10 mg/mL時(shí)具有促進(jìn)作用外，其余各濃度均表現(xiàn)不同程度的抑制作用，且具有隨處理濃度升高而增強(qiáng)的效應(yīng)，各部位對(duì)赤豆種子萌發(fā)的抑制強(qiáng)弱表現(xiàn)為葉>莖>根，與前期對(duì)綠豆種子萌發(fā)結(jié)果[16]相似，張志忠等在空心蓮子草對(duì)生菜和蘿卜的化感作用研究中也得出相似的結(jié)果[24]。

AEA還影響赤豆幼苗生長(zhǎng)，且也表現(xiàn)出濃度效應(yīng)，尤其葉片AEA對(duì)赤豆幼苗影響最為明顯，隨處理濃度增加，生長(zhǎng)高度和健康狀況逐步減弱(圖1、圖2、圖3)，當(dāng)葉片AEA濃度為40 mg/mL，對(duì)赤豆幼苗莖長(zhǎng)和鮮質(zhì)量RI值最低，分別為 -4.109、-3.764(表1)，說明對(duì)赤豆幼苗生長(zhǎng)的抑制化感效應(yīng)最強(qiáng)，該結(jié)果與以往的研究結(jié)果相似[22]，同樣，再力花地下部分水浸液對(duì)水生植物生長(zhǎng)也具有抑制作用[25]。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，形成自身體內(nèi)的保護(hù)套系統(tǒng)，這套系統(tǒng)一般是由POD、SOD等酶組成，其作用是避免細(xì)胞膜受到膜脂過氧化造成的傷害、維持細(xì)胞內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡[17]。POD是一種適應(yīng)性酶，植物對(duì)外界環(huán)境變化適應(yīng)和植物生長(zhǎng)發(fā)育與體內(nèi)代謝變化都與POD活性密切相關(guān)[18]。本研究中POD活性隨浸提液濃度升高而增強(qiáng)，其原因可能是外界環(huán)境導(dǎo)致赤豆幼苗中活性氧、自由基增多，因此植物自身須要產(chǎn)生更多的POD來消除自由基。SOD也是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[19]。但SOD活性隨浸提液濃度升高反而呈下降趨勢(shì)，其可能原因是浸提液對(duì)赤豆幼苗的影響超過SOD調(diào)節(jié)的閥值，對(duì)植物造成傷害，導(dǎo)致SOD活性降低，還可能是酚類物質(zhì)對(duì)POD、SOD有影響，劉建國在對(duì)棉花的研究中發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)對(duì)POD活性具有促進(jìn)作用[26]，但隨著酚類物質(zhì)濃度升高，對(duì)SOD活性的抑制越明顯[20]。

AEA對(duì)赤豆幼苗丙二醛含量的影響為隨處理濃度升高，丙二醛含量增多，這與鄭世英等在玉米中的結(jié)果[27]一致。其原因是植物在逆境環(huán)境中受到傷害就會(huì)產(chǎn)生MDA，且傷害越大，MDA含量越多[23]。然而，在本研究中，各部位不同濃度AEA處理下赤豆幼苗葉綠素含量變化沒有明顯規(guī)律，但除根AEA濃度為10和20 mg/mL處理的赤豆幼苗葉片葉綠素含量有所降低外，其他各濃度處理葉綠素含量均表現(xiàn)出與對(duì)照相當(dāng)或顯著高于對(duì)照。黃花蒿對(duì)植物幼苗葉綠素含量的影響，因受試對(duì)象不同而有差異，如其化感物質(zhì)-青蒿素對(duì)豇豆(VignasinensisL.)和菜豆(PhaseolusvulgarisL.)幼苗的葉綠素含量有促進(jìn)作用，對(duì)小白菜(Brassicachinensis)和大白菜(Brassicapikenensis)幼苗葉綠素含量有抑制作用[9]，本研究結(jié)果與前2種豆類相似，具體原因有待進(jìn)一步研究。

總之，AEA抑制赤豆種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出明顯的來源部位(根、莖、葉)差異和濃度效應(yīng)，通過影響幼苗的生理活性，從而導(dǎo)致幼苗的不健康生長(zhǎng)。