●伍佰鑫 張 勇 李昊幫 何 芳 浣 成 編譯

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所 湖南 長沙 410131；2.湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣獸醫(yī)局 湖南 湘西 416800）

黃嘌呤核苷（以下簡稱黃嘌呤）添加到不對稱分裂的干細(xì)胞時，會誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)向?qū)ΨQ分裂，最終導(dǎo)致干細(xì)胞的增殖。黃嘌呤對細(xì)胞不對稱分裂的抑制作用，是通過肌苷磷酸脫氫酶（轉(zhuǎn)化為5’-單磷酸黃嘌呤）來調(diào)節(jié)的，因此，黃嘌呤在肌苷磷酸脫氫酶調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。

乳汁是由乳腺上皮細(xì)胞分泌的，乳腺上皮細(xì)胞在泌乳期逐漸脫落并不斷補充，這些細(xì)胞的基因表達(dá)差異，很可能是整個泌乳過程的主要原因。從乳腺中分離和富集乳腺上皮細(xì)胞用于轉(zhuǎn)錄譜分析的方法之一是，對乳腺組織進(jìn)行手術(shù)活檢，然后制備單細(xì)胞懸浮液，并在體外培養(yǎng)增殖；方法之二是，運用免疫磁性方法，從乳汁體細(xì)胞中分離乳腺上皮細(xì)胞。最近，又有學(xué)者嘗試從乳脂層捕獲乳脂球，再萃取乳腺上皮細(xì)胞，因為乳脂球包含乳腺上皮細(xì)胞質(zhì)殘留物，在光學(xué)顯微鏡下顯示月亮形外觀。不同種類的哺乳動物具有不同百分比體積的乳脂球新月形體（人類母乳3%～8%，牛奶少于1%）。作為細(xì)胞質(zhì)起源的乳脂球新月形體，是乳腺上皮細(xì)胞特異性核糖核酸的來源。運用微數(shù)列和RNA測序，分析人類母乳的乳脂球轉(zhuǎn)錄物組，證實了乳脂球轉(zhuǎn)錄物組包括在乳腺上皮細(xì)胞中唯一表達(dá)的基因。

為了鑒別乳腺上皮細(xì)胞中的黃嘌呤誘導(dǎo)和基因表達(dá)差異，印度學(xué)者從山羊泌乳早期的羊奶乳脂球分離RNA（核糖核酸），進(jìn)行了總RNA深度測序等試驗[1]。這對國內(nèi)羊奶生產(chǎn)的深層次研究具有彌補空白和借鑒作用。

1 研究方法

1.1 半個乳房注射黃嘌呤

8頭初產(chǎn)山羊，每頭山羊有1個乳房、2個乳頭；試驗組和對照組各為1個乳頭及其對應(yīng)的半個乳房（總共88）。將黃嘌呤粉末用無菌生理鹽水稀釋，配制成10mmol/L的黃嘌呤懸浮液，再用0.22m過濾器消毒；試驗組每頭山羊的半個乳房通過乳頭注射20mL黃嘌呤懸浮液，另外深入乳房實質(zhì)內(nèi)再注射1mL（以確保黃嘌呤進(jìn)入乳腺周邊區(qū)域），連續(xù)注射3天，每天早、晚各注射1次（擠奶后再用消毒的20號鈍針插入乳頭管提取殘余奶，確保完全無乳后立即操作）。對照組不注射。最后1次注射黃嘌呤之后，試驗組和對照組乳頭擠出的奶都要分開收集。

1.2 羊奶用吖啶橙染色

將收集的鮮奶與0.1%的吖啶橙混合，室溫培養(yǎng)5分鐘染色DNA和RNA；將10L吖啶橙染色的牛奶放置在帶正電荷的幻燈片上，用蓋玻片覆蓋，然后用指甲油密封，防止牛奶蒸發(fā)。立即在倒置熒光顯微鏡（日本）上觀看幻燈片，每個幻燈片捕獲2個圖像，紅色熒光通道TRITC作為吖啶橙插層RNA，綠色熒光通道FITC作為吖啶橙插層DNA。觀察到的RNA呈現(xiàn)紅色，DNA呈現(xiàn)綠色（形狀像標(biāo)點符號的鈍號，大小和方向不同），乳脂球呈現(xiàn)暗色的球狀結(jié)構(gòu)（大小不一），這些乳脂球新月形體和隔膜是乳腺上皮細(xì)胞特異性RNA的來源。

1.3 從乳脂球分離RNA

運用抽提試劑和哺乳動物總RNA分離套件（美國）提取總RNA，也就是說，每次取40mL奶樣離心；用1mL無菌微量吸液槍的尖端收集500～700g乳脂，滴入5mL無核酸酶的試管（印度），管內(nèi)含有1.5mL試劑（Trizol美國），乳脂在試劑中渦流均質(zhì)化2～3分鐘，均質(zhì)后的混合物室溫培養(yǎng)3分鐘，80℃保存。用手掌摩擦方法進(jìn)行快速解凍、渦旋、離心（12 000轉(zhuǎn)）5分鐘（4℃），移除頂部過多的脂肪；將干凈的中間層勻漿移入另外一個新的2mL試管（沒有RNA酶），內(nèi)含300L氯仿（即三氯甲烷），用力搖動試管30秒后，室溫培養(yǎng)10分鐘以便脂肪完全溶解；4℃離心（12 000轉(zhuǎn)）15分鐘，取300L上清液，用哺乳動物總RNA分離套件（美國）提取總RNA，用NanoDrop1000（美國）給RNA定量；用Tapestation（美國）測定RNA完整性。

1.4 RNA測序

由于經(jīng)費限制和乳脂源RNA測序的可行性，只有2頭山羊進(jìn)行了RNA測序，試驗組和對照組各占2個文庫。每個文庫的建立，運用RNA樣本準(zhǔn)備套件（TruSeq美國），分離和準(zhǔn)備5～10g總RNA；用凝膠電泳法測定測序文庫的大小分布；使用熒光定量系統(tǒng)（Qubit3.0美國）對文庫進(jìn)行定量；在Illumina's HiSeq2 500平臺上進(jìn)行配對測序；每個樣本建立約4 000萬對末端、2 100bp讀取的文庫。

測序公司（商業(yè)性）對原始序列進(jìn)行初步的質(zhì)量檢查，也就是說，從數(shù)據(jù)組中篩選出包含適配器的讀??；為了避免堿基組成的偏差，在兩對讀取的5號末端裁剪了12個堿基，應(yīng)用STAR軟件進(jìn)行序列比對，應(yīng)用cufflinks軟件對基因和轉(zhuǎn)錄本的原始表達(dá)進(jìn)行定量（千個片段/百萬）。對試驗組和對照組的RNA分布進(jìn)行比較。

1.5 cDNA合成及多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

運用逆轉(zhuǎn)錄超混合裝置（美國），從1 000ng總RNA合成第一鏈cDNA，20℃保存。對于從乳脂球分離出的RNA，用實時熱環(huán)儀（美國）對基因表達(dá)中的變化進(jìn)行定量。根據(jù)山羊mRNA（信使核糖核酸）序列的參考資料（購買于NCBI），設(shè)計基因特異性引物。每個10L的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包含0.25L的正向和反向引物（2.5pmol）、5L的熒光染料（美國）、3L 的cDNA（1∶10稀釋）和1.5L水（沒有核酸酶）。步驟是95℃保持3分鐘、95℃保持10秒（變性）重復(fù)循環(huán)340次，分別在退火溫度停留30秒；95℃保持3分鐘、65℃保持30秒，然后每次0.5℃增加到95℃（解鏈曲線）。每次試驗都包括一個非模板對照和一個非逆轉(zhuǎn)錄酶對照，總共選取22個基因（黃嘌呤試驗組）進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析。

2 研究結(jié)果

從山羊乳脂獲得的總RNA濃度平均值為770.12±754.7ng/L；260/280和260/230的光密度比率分別是2.04±0.04和1.84±0.38；所有RNA樣本都適合多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析。從最初的16組RNA樣本中選擇了4個（RNA完整性數(shù)值大于7）進(jìn)行了RNA測序，平均映射讀取的百分比是93.4±2.1；每個樣本有10 267～11 470個基因、FPKM（百萬外顯子的堿基片段）值≥0.2，表示某種水平的可檢測轉(zhuǎn)錄，這些轉(zhuǎn)錄本的功能注釋，豐富了細(xì)胞和代謝途徑（與催化和結(jié)合活動有關(guān)）。在4個RNA測序樣本中，每個樣本的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)都很低（FPKM＜15；84.3%）；對于大量表達(dá)的基因（FPKM≥500），觀察到細(xì)胞和代謝過程的富集（基于PANTHER分類體系）。最豐富表達(dá)的基因有脂滴包被蛋白（PLIN2參與乳脂球形成的蛋白質(zhì)）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP3）和山羊早期泌乳過程中的許多核糖體蛋白（CSN3、LALBA、PAEP、GLYCAM1、TPT1）。

試驗組大量表達(dá)的基因顯示核糖體通路的強樞紐和分子功能；在對照組核糖體通路中，這些基因中的大多數(shù)同樣與細(xì)胞和代謝過程有關(guān)。試驗組存在與編碼關(guān)鍵核糖體相關(guān)的蛋白（GNB2L1、EEF1B2、TPT1），與核糖體相關(guān)的基因家族明顯富集，包括核糖體基因的結(jié)構(gòu)成分（RPL4、RPS9、RPS10等）。此外，乳蛋白基因（LALBA、CSN2、CSN3、PAEP、CSN1S1）在試驗組和對照組均有高表達(dá)。黃嘌呤處理之后，差異表達(dá)的基因共有58個（46個下調(diào)、12個上調(diào)）。下列生物過程的基因出現(xiàn)富集：對其他器官的防御反應(yīng)、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的信號通路、對其他刺激回應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、對內(nèi)源性刺激的回應(yīng)。最多的細(xì)胞成分與細(xì)胞表面（10個基因）和質(zhì)膜（15個基因）相關(guān)。黃嘌呤處理不會引起乳腺組織損傷。另外，發(fā)現(xiàn)試驗組的乳鐵傳遞蛋白上調(diào)、Fos原癌基因下調(diào)。證實了（NCBI）山羊測序數(shù)據(jù)庫缺失3個干細(xì)胞標(biāo)記（HNF4ANR5A2、MSI1、FNDC3B）；羊奶乳脂肪中的SELL和THBS1基因轉(zhuǎn)錄本的豐度極低。

總而言之，羊奶脂肪層的研究，展示了山羊乳腺上皮細(xì)胞基因表達(dá)的特征。給山羊乳腺注射黃嘌呤，乳腺上皮細(xì)胞的基因表達(dá)出現(xiàn)差異，可增加乳腺干細(xì)胞的數(shù)量（提高產(chǎn)奶量），同時不影響乳腺干細(xì)胞群。黃嘌呤對于抑制炎癥信號通路、抗菌基因上調(diào)和細(xì)胞黏附分子具有重要作用。炎癥信號的下調(diào)和抗菌基因的上調(diào)，還可能對乳腺健康產(chǎn)生有益的影響。

3 討論

隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，RNA測序已成為基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析的重要手段[2]，能夠從整體水平研究基因功能及其結(jié)構(gòu)[3]。畜禽轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究是國內(nèi)外生命科學(xué)研究的熱點內(nèi)容[4]。崔曉鋼（2015）對中國荷斯坦牛乳腺上皮組織進(jìn)行RNA測序分析，得到31個差異表達(dá)基因，這些基因富集在蛋白代謝，脂肪代謝，細(xì)胞生長、凋亡、分化，免疫細(xì)胞活化以及乳腺發(fā)育等生物過程[5]。

山羊奶富含短中鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸，具有獨特的營養(yǎng)價值和風(fēng)味，泌乳過程中的乳腺組織脂肪酸代謝是影響乳中脂肪酸組成的重要生理過程。過氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）是核受體PPARs家族中重要的一員，對脂肪酸代謝、脂滴形成與分泌等生理過程發(fā)揮調(diào)控作用。通過分析PPAR基因啟動子結(jié)構(gòu)及功能，為奶山羊乳脂代謝調(diào)控和羊奶風(fēng)味形成機(jī)理研究提供了重要理論與實驗依據(jù)[6]。

羊奶在國際上被譽為“奶中之王”，羊奶的脂肪顆粒體積為牛奶的1/3，更利于人體吸收；羊奶中的維生素及微量元素明顯高于牛奶，可能原因是奶牛一般舍飼，而山羊一般是放牧，能夠采食更多的青草。隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異，人們對山羊奶的認(rèn)識進(jìn)入深層次，宜進(jìn)一步利用RNA測序，研究黃嘌呤核苷增加羊奶生產(chǎn)的具體數(shù)量（質(zhì)量），以改變單一乳品結(jié)構(gòu)（牛奶），滿足越來越多的人群對其他乳品（羊奶）的需求。