蔡碧瑩 羅曦蕓 徐志珍 夏瑋 張文清

摘要： 文章選用古代常用于染色的六種植物，針對絲織品的染色方法展開研究，擴(kuò)充建立紅、黃、紫色多組顏色的檢測體系，最終用于鑒定出土絲織品文物上植物染料的組成成分。為解決絲織品文物豐富顏色的分析問題，文章建立了基于自建精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫的方法，使用四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-QTOF-MS），對植物染料的化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定，并探究同位素模式對鑒定結(jié)果的影響，增強(qiáng)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，文章所建立的數(shù)據(jù)庫可以解決大量出土文物的植物染料鑒定問題，對文物的修復(fù)和文化的繼承都具有十分重要的意義。

關(guān)鍵詞： 絲織品文物;植物染料;染料顏色;色質(zhì)聯(lián)用;分子數(shù)據(jù)庫

中圖分類號： TS193.62 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? 文章編號： 1001-7003（2019）06-0012-07 ? 引用頁碼： 061103

Abstract： Six plants which were commonly used for dyeing in ancient times were chosen to study the dyeing method of silk fabrics， and red， yellow and purple testing system was established to identify the compositions of plant dyes on the unearthed silk fabric relics. To solve the problem of rich color analysis of silk fabric relics， the precise quality database was established， and UHPLC-QTOF-MS was used to fast identify the chemical compositions of plant dyes. Meanwhile， the influence of isotope mode on the identification result was explored to enhance the accuracy and credibility of identification results. The experimental results showed that the database established in this study could solve the problem of plant dyes identification on unearthed cultural relics， which is of great significance to the restoration and inheritance of cultural relics.

Key words： silk fabric relics; plant dyes; dye color; UHPLC-QTOF-MS; molecular database

紅色，是中國的傳統(tǒng)顏色，也是人們最鐘愛和崇尚的色彩之一，茜草、紅花、蘇木作為中國古代紅色植物染料具有悠久的歷史[1-3]。黃色，在中國傳統(tǒng)文化里代表帝王之色[4]，姜黃、槐米為古代染制黃色的主要植物染料。紫色，在中國古代是一種極其重要的顏色，常為宮廷所用[5]，紫草為古代染制紫色的主要植物染料。古代絲織品文物植物染料的科學(xué)檢測鑒定是中國紡織品科技考古和鑒定工作的重點(diǎn)，明確染色文物染料的種類和植物來源，對文物清洗、修復(fù)、復(fù)制都有著十分重要的作用。

超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-QTOF-MS）集合UHPLC快速高效的分離優(yōu)勢[6]和QTOF質(zhì)譜高分辨、能采集大量物質(zhì)信息等特點(diǎn)[7]于一體，既適用于與在線精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫聯(lián)用，以開發(fā)物質(zhì)的快速篩選和鑒定方法，又可提供全掃描模式下和數(shù)據(jù)庫匹配的一級質(zhì)譜母離子的進(jìn)一步碎片信息。因此，對于復(fù)雜成分的分離鑒定具有操作簡便、準(zhǔn)確高效的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于植物染料和其他復(fù)雜物質(zhì)的化學(xué)成分定性分析中[8-9]。

基于異常珍貴的紡織品文物可供萃取分析的染料纖維極為稀少、含量極低的情況，本實(shí)驗(yàn)采用模擬古代染色方法染制紅色、黃色、紫色真絲織物，并利用自建精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫對真絲織物剝色液成分進(jìn)行分析，從而確定各染料染色真絲織物的有效成分，為實(shí)際文物染料成分的定性分析和染料植物的歸屬奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

材料：100%桑蠶絲電力紡（杭州米賽絲綢有限公司），無水乙醇、甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（上海賽默飛世爾科技有限公司），碳酸鉀、檸檬酸、氫氧化鈉、明礬（分析純）、蘆?。兌?95%）、茜草素（純度>98%）、盧西定（純度>99%）、巴西蘇木素（純度>98%）、姜黃素（純度>98%）、紫草素（純度>98%）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。茜草、紅花、蘇木、姜黃、槐米、紫草（上海奧淼中藥材有限公司），文物樣品（上海博物館文物保護(hù)科技中心）。

儀器：Agilent 1290 UHPLC-6530QTOF-MS/MS（安捷倫科技（中國）有限公司），USC-502型超聲儀和DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），AE24型分析天平（梅特勒-托利多中國），MTN-2800W水浴氮吹儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），WKZ-4型中藥粉碎機(jī)（青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司），Master-S15 UVF超純水儀（上海和泰儀器有限公司），Coloreye XTH手提式色差儀（上海愛色麗有限公司）。

1.2 染色樣品的制備

染色前將桑蠶絲織物在75℃中性水中浸泡20min，并持續(xù)攪拌，去掉織物表面可能存在的工業(yè)添加物質(zhì)，用蒸餾水清洗晾干。將染料植物粉碎成20～60目粉末，以增加植物染料與提取溶劑的接觸面積，提高提取率[10-12]。

將10g的槐米浸泡在無水乙醇和去離子水（1 ︰ 1）的100mL混合液中，置于室溫下浸泡24h。將浸泡后的混合物過濾，除去雜質(zhì)和沉淀物，即得到澄清黃色植物提取液。茜草、蘇木、姜黃、紫草的提取方法同槐米。姜黃、槐米、紫草采用直接染色法，將織物在相應(yīng)的植物提取液中室溫浸泡12h，水洗晾干后即得到染色織物。茜草、蘇木采用明礬前媒染法，先將織物浸泡在2g/L的明礬水溶液中，媒染溫度為45℃，時間20min，水洗晾干后在相應(yīng)的茜草、蘇木植物提取液中室溫浸泡12h，水洗晾干后即得到茜草、蘇木染色織物。

將10g紅花加到15℃以下的500mL冷水中，揉搓搗爛后，于陰冷處放置12h，絞擠棄去濾液，再加入500mL冷水揉搓，放置30min，重復(fù)若干次后過濾得除去黃色素的紅花。在紅花中加入40mL冷水和04g碳酸鉀，充分?jǐn)嚢枞啻辏胖?0min后，用紗布袋過濾得到黃褐色提取液。重復(fù)操作2～3次，合并提取液。對提取液邊攪拌邊加入檸檬酸中和，使之為中性。將桑蠶絲織物置于該中性提取液中，染色溫度35℃，染色時間30min。染色后水洗，將其放入含有0.5g/L檸檬酸的水中發(fā)色20min，水洗晾干后即得到紅花染色織物。

1.3 染色樣品的處理

采用D65（標(biāo)準(zhǔn)日光，色溫為6500K）光源單方向（45°）照明，同一環(huán)境下用色差儀測定染色絲織品的色度值，L、a、b值由Coloreye XTH手提式色差儀采集記錄，并計算不同批次染色織物的色差值（ΔE），ΔE=[（ΔL）2+（Δa）2+（Δb）2]1/2。

準(zhǔn)確稱取染色絲織品樣品各（10±1）mg置于10mL離心管中，茜草、紅花、蘇木、紫草染色后的織物加入1mL甲醇 ︰ 丙酮 ︰ 乙酸（2 ︰ 2 ︰ 1）剝色溶液，姜黃、槐米染色后的織物加入1mL甲醇 ︰ 乙酸（1 ︰ 1）剝色溶液，80℃超聲提取50min。將剝色提取液氮吹至完全吹干，再加甲醇復(fù)溶到150μL，用1mL注射器吸取剝色提取液，用0.22μm有機(jī)相濾頭過濾后進(jìn)行色譜分析。

1.4 精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫的建立

將60種植物染料成分的分子式和名稱整理成表，保存成csv格式的文件。將該文件導(dǎo)入Agilent MassHunter （Version B.06.00， Agilent， USA） 高級質(zhì)譜處理軟件的個人物質(zhì)數(shù)據(jù)庫及圖書館（Personal Compound Database and Library， PCDL）模塊中，軟件可自動計算其相對分子質(zhì)量（精確到小數(shù)點(diǎn)后四位），即生成了精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫（accurate-mass database），用于一級質(zhì)譜中的分子式匹配。此外，一級質(zhì)譜中所得到的各物質(zhì)的保留時間可以繼續(xù)導(dǎo)入PCDL，以增強(qiáng)后續(xù)二級質(zhì)譜的針對性。

1.5 LC-MS分析條件

1.5.1 UHPLC參數(shù)

色譜柱：Agilent Extend C18 UHPLC reversed-phase column （2.1mm×50mm，1.8μm），柱溫30℃，流速0.25mL/min，進(jìn)樣量1μL;流動相：A路為0.1%甲酸的水溶液，B路為乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～9min，A路比例由95%下降到5%;9～10.3min，A路比例為5%;10.3～10.5min，A路比例由5%上升到95%;檢測波長280nm。

1.5.2 QTOF參數(shù)

采用QTOF模式的負(fù)離子模式掃描（ESI-）采集樣品的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，優(yōu)化好的質(zhì)譜參數(shù)如下：霧化氣溫350℃，霧化器流速10L/min，霧化氣壓30psig，毛細(xì)管電壓3000V，毛細(xì)管出口電壓150V，掃描范圍50～1000amu。內(nèi)標(biāo)校正離子：m/z 112.9859 和1033.9881，對分析結(jié)果進(jìn)行實(shí)時質(zhì)量校正。目標(biāo)二級離子模式（Targeted MS/MS）的碰撞電壓值，依據(jù)目標(biāo)離子碎裂的難易程度設(shè)定為20eV和30eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色結(jié)果

CIELAB色空間是由國際照明委員會（CIE）建立的一種色彩空間，由反映色彩范圍的三通道組成[13]。在該空間中L為明度，L值越大表示顏色越白，L值越小表示顏色越黑;a、b為色度坐標(biāo)，其中a為正值表示顏色偏紅，a為負(fù)值表示顏色偏綠;b值為正值表示顏色偏黃，b值為負(fù)值表示顏色偏藍(lán)。不同批次所染織物的顏色特征值和顯色效果如表1所示，其色差變化值均小于1.5個NBS色差單位，目測難以發(fā)現(xiàn)色差，說明染色方法重復(fù)性較高。在紅色織物中，紅花染制的織物色度值a最高，茜草媒染后的織物偏橙黃色，蘇木媒染后的織物為深紅色。在黃色織物中，姜黃上色效果最明顯，b值達(dá)到81.67，槐米染制的織物為嫩黃色。

2.2 染料成分的分析

2.2.1 剝色提取液的鑒定過程

取各染色絲織品剝色液的混合液，進(jìn)行色譜條件優(yōu)化。該過程不同于普通液相色譜：在不同液相條件下，分別進(jìn)行一級質(zhì)譜自動分子式匹配，匹配色譜峰數(shù)量最多的色譜條件即為最優(yōu)條件。使用優(yōu)化好的色譜條件分離后，首先進(jìn)行一級質(zhì)譜自動分子式匹配。由于大部分染料成分在負(fù)離子模式下均可獲得較好的電離，故選用負(fù)離子模式，使用m/z 1129859和1033.9881的兩個內(nèi)標(biāo)校正離子，對分析結(jié)果進(jìn)行實(shí)時質(zhì)量校正;并設(shè)定分?jǐn)?shù)值小于60.0的分子不執(zhí)行匹配。共匹配到28種物質(zhì)，選取分?jǐn)?shù)高于85.0的物質(zhì)共16種，進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜匹配。

將各分子離子峰的測定m/z值、一級質(zhì)譜模式下的保留時間和誤差時間（設(shè)定為0.5min，即原保留時間±0.5min的保留時間范圍內(nèi)，捕捉到的設(shè)定質(zhì)量數(shù)的分子離子均可被進(jìn)一步碰撞，以避免保留時間漂移造成漏檢）保存成csv格式的文件，導(dǎo)入MassHunter，即為二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，QTOF可自動按照該數(shù)據(jù)庫提供的母離子質(zhì)荷比及保留時間范圍等信息，碰撞指定離子，得到它們的子離子信息。將每一種物質(zhì)的子離子按照碎裂規(guī)律進(jìn)行歸類，并將其m/z值與文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫和標(biāo)準(zhǔn)品對照，實(shí)現(xiàn)染色樣品剝色液中各物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定。以Aliazrin為例，其分?jǐn)?shù)值為99.55（圖1（a）），使用提取離子流圖模式，可得到其色譜圖，進(jìn)一步施加碰撞能量，產(chǎn)生子離子（圖1（b）），將其與文獻(xiàn)值和標(biāo)準(zhǔn)品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)對照，確定其為Aliazrin。

2.2.2 關(guān)于同位素模式和分?jǐn)?shù)值的討論

為保證數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果的可靠性，需要進(jìn)一步對匹配結(jié)果進(jìn)行篩查。由于天然同位素的存在，負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖除分子離子峰A外，還會出現(xiàn)多種同位素離子峰，對應(yīng)的m/z值分別為A+1、A+2等。因此，在同位素模式下，一個分子離子峰的同位素離子豐度和幾個同位素離子峰的峰間距理論值可以成為判定其分子結(jié)構(gòu)的重要依據(jù)。

數(shù)據(jù)庫匹配的得分?jǐn)?shù)由三個因素決定：質(zhì)量數(shù)（即得到的分子離子峰的m/z值是否符合理論值），同位素豐度（即得到的同位素離子的豐度是否符合理論計算值）及同位素峰間距（即得到的同位素離子的峰間距是否符合理論計算值）。分?jǐn)?shù)值由以上三個因素加權(quán)計算得到，范圍在0～100，分?jǐn)?shù)越高，一級匹配的準(zhǔn)確度越高。通常情況下，分?jǐn)?shù)超過60分，則表明匹配得到的分子式是正確的。比如，在對Brazilin（結(jié)構(gòu)見圖2，分子式為C16H14O5）的一級質(zhì)譜鑒定過程中，其理論[M—H]-的m/z值為285.0768，實(shí)際測定值為285.0767，相差僅0.0001（一般在高分辨質(zhì)譜中，測定值與理論值相差小于0.0010才能認(rèn)為質(zhì)量數(shù)匹配），表明得到的分子離子峰的m/z值符合理論值;同位素的豐度和間距均在軟件的預(yù)測范圍內(nèi)。測定結(jié)果在質(zhì)量數(shù)、同位素豐度和同位素間距這三個方面匹配程度均非常高，因此加權(quán)得到的分?jǐn)?shù)值也非常高，達(dá)到了99.10，表明分子式匹配結(jié)果是正確的，可以進(jìn)行后續(xù)的二級質(zhì)譜測定。

2.2.3 剝色液成分鑒定結(jié)果

得到的二級質(zhì)譜碎片信息與文獻(xiàn)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（Chemspider， http：//www.chemspider.com/）進(jìn)行對比，以實(shí)現(xiàn)各物質(zhì)的鑒定。部分物質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)品的UHPLC保留時間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片m/z加以證實(shí)。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品比對及文獻(xiàn)對照，一共鑒定出10種物質(zhì)，它們的保留時間、[M—H]-精確質(zhì)量數(shù)、特征子離子碎片、分子式和分?jǐn)?shù)值見表2。

2.2.4 實(shí)際文物鑒定結(jié)果

古代樣品在成分未知的情況下，不可能選用對染料最合適的剝色溶劑。但根據(jù)顏色可做出初步判斷，根據(jù)樣品纖維表觀顏色為紅色，最終采用同蘇木等紅色絲布的剝色方法，樣品處理方法見1.3。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫的匹配分析，實(shí)際文物樣品中含有茜草染制絲織物的特征染料成分羥基茜草素（Purpurin）和茜草素（Aliazrin），且匹配分?jǐn)?shù)高達(dá)98.94%和98.85%，推斷染料植物為茜草。由于此次可供液質(zhì)分析的文物樣品纖維十分稀少，一級質(zhì)譜信號強(qiáng)度低僅為102，不宜進(jìn)行后續(xù)二級質(zhì)譜分析，但通過數(shù)據(jù)庫的匹配可篩選出特征染料成分，從而進(jìn)一步推斷染料植物。

3 結(jié) 論

1）與分析植物染料提取液相比，采用自染色自剝色的方法更接近實(shí)際文物的分析過程。通過對染色絲織品中植物染料成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，可使染料分析形成更完整的體系，以解決更多出土文物的植物染料鑒定問題，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

2）與傳統(tǒng)液質(zhì)聯(lián)用方法相比，本文基于自建精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫并采用高分辨質(zhì)譜軟件下的同位素模式，通過給出特征同位素分布，可大大縮小假設(shè)的原子組成范圍，從而增強(qiáng)了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。即使在嚴(yán)重缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，也可基本保證分子式匹配結(jié)果的正確性，進(jìn)一步減小后續(xù)的結(jié)構(gòu)鑒定和物質(zhì)篩選的難度。對于類似體系，如其他植物提取物的快速鑒定，也同樣具有一定的普適性和應(yīng)用價值。

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