余 剛,劉自逵,,4*,張運(yùn)強(qiáng),劉輝旺
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2 湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司,湖南 瀏陽 410329;3.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128;4.北京精免大觀生物科技研究院有限公司,北京 100096)
臨床上可觀察到患非洲豬瘟的豬會(huì)發(fā)生特大的敗血脾、肝臟的脂肪變性、大葉性肺炎,胸腔與腹腔積液、紅染,淋巴結(jié)特別是頸部淋巴結(jié)變黑、出血,全身廣泛性出血與炎癥等。
ASF 是直接接觸性、惡性傳染病,不接觸無傳染。非洲豬瘟病毒(ASFV)為非洲豬瘟屬的唯一成員、唯一的蟲媒DNA 雙股螺旋病毒,其本身缺乏核蛋白體、線粒體、代謝酶系統(tǒng)和能量等,病毒自身不能在環(huán)境中增殖,必須侵入宿主的細(xì)胞才能進(jìn)行復(fù)制,用PCR 檢測(cè)出核酸陽性豬只并不一定具有感染性。2018 年8 月3 日我國首次報(bào)道,后確定其毒株為格魯吉亞Ⅱ型強(qiáng)毒株,它傳染性低但致死率非常高,初次感染可達(dá)100%,隨著時(shí)間的推移病毒毒力有下降的趨勢(shì),目前在廣東省發(fā)生的非洲豬瘟的情況,致死率沒有100%,有一部分豬會(huì)存活下來,但在廣西發(fā)生的情況有所區(qū)別,其致死率還能達(dá)到100%。
鼻腔和口腔是主要的感染門戶,消化道和呼吸道黏膜的完整以及共同黏膜免疫屏障對(duì)防控非洲豬瘟是有幫助的。有人做了一個(gè)試驗(yàn),通過口腔注射102HAD50(半數(shù)紅細(xì)胞吸附量)病毒量豬只不感染,但鼻腔注射102HAD50則出現(xiàn)顯著感染現(xiàn)象,說明經(jīng)鼻感染比經(jīng)口感染要容易得多;還有人驗(yàn)證,在飼料中的最小感染量為104TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染量),而在水中的最小感染量只為100TCID50,說明該病毒喜歡潮濕的環(huán)境,干燥對(duì)防控非洲豬瘟是非常有效的,而要通過飼料途徑感染非洲豬瘟的可能性比較小,是安全的。
非洲豬瘟病毒首先感染咽峽的扁桃體并刺激產(chǎn)生抗體,并建立起病毒復(fù)制點(diǎn)(ASFV 主要在宿主單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等中復(fù)制,借助巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用而入侵宿主細(xì)胞,并借助宿主細(xì)胞本身的代謝環(huán)境、原料、能量和復(fù)制場(chǎng)所進(jìn)行繁殖子代病毒)。然后侵入豬頭部與頸部的淋巴結(jié)如咽后淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、腮腺淋巴結(jié)、氣管支氣管淋巴結(jié)等,并在此繼續(xù)產(chǎn)生抗體。由于抗體的調(diào)理作用導(dǎo)致了ASFV 感染肺部大量的巨噬細(xì)胞,經(jīng)過右淋巴導(dǎo)管或左氣管干進(jìn)入頸靜脈、前腔靜脈,并隨心臟運(yùn)送到全身毛細(xì)血管,建立血管內(nèi)皮細(xì)胞的持續(xù)感染和頑固性的病毒血癥。ASFV 隨血液循環(huán)進(jìn)入肺臟、心臟、肝臟和脾臟后,會(huì)引發(fā)心肌炎、肝臟脂肪變性與硬化、大葉性肺炎等,導(dǎo)致胸腔、心包與腹腔積液、紅染。大量病毒隨血液侵入脾臟并刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生大量抗體,在血管內(nèi)形成大量可溶性Ag-Ab 復(fù)合物,堆積在血管內(nèi)皮表面,引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,使得炎癥趨化因子IL-1、IL-6 和TNF-α 大 量 表 達(dá), 引發(fā)毛細(xì)血管末梢微血栓形成、多種器官組織的微血管損傷與破裂和Ⅲ型超敏反應(yīng),病豬迅速開始表現(xiàn)發(fā)病與死亡。
ASFV 的終末宿主為豬和疣豬,唯一的中間宿主為鈍緣軟蜱。終末宿主和中間宿主相對(duì)來說比較單一。其他各種媒介如蒼蠅、蚊子、老鼠、飛鳥、人體、土壤、水源及各種用具等只能攜帶病毒,并不能復(fù)制和增殖病毒。
ASFV 只能在宿主細(xì)胞內(nèi)存活與增殖,在非宿主細(xì)胞內(nèi)、其他物體的表面及內(nèi)部或已經(jīng)死亡的宿主細(xì)胞內(nèi)都不能增殖,并且其感染性也會(huì)逐漸消失,因此,ASFV 在死豬、豬肉制品如臘肉、熟肉、香腸、血腸和肉丸等、糞便、泔水等處只能停留、不能增殖。有必要對(duì)所有用具、物品、車輛、人員、飼料和水源等進(jìn)行嚴(yán)格清洗、消毒或駐留足夠長(zhǎng)的時(shí)間來降低病毒攜帶量,在接觸中間宿主和終末宿主之前讓其完全喪失致病力。
2.1.1 消毒是降低環(huán)境病毒載量的最有效方式
消毒劑的選擇與消毒方式、消毒濃度、消毒溫度、作用時(shí)間、環(huán)境的清潔度、環(huán)境中有機(jī)物質(zhì)的含量、水質(zhì)等因素,對(duì)消毒的效果影響非常大。因此,有必要對(duì)各種消毒劑、消毒方式等在不同環(huán)境中確實(shí)的消毒效果進(jìn)行調(diào)查,不可盲目使用。同時(shí),還應(yīng)避免過度消毒對(duì)環(huán)境、水源、飼料的污染破壞等,更應(yīng)避免帶豬消毒如濕度增加、溫度變化、潔度和刺激度的變化。消毒作用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:1)使病毒蛋白質(zhì)發(fā)生變性,利用強(qiáng)酸如甲酸、醋酸、苯甲酸、磷酸、乳酸、丁酸、富馬酸及其鹽類,強(qiáng)堿如火堿、生石灰及其鹽類;2)與病毒蛋白進(jìn)行不可逆的結(jié)合,各種鄰苯基苯酚,醛如甲醛、乙醛、戊二醛、苯扎溴銨和十二烷基磺酸鈉等,還有各種陽離子表面活性劑如洗滌劑、雙鏈季胺鹽、次氯酸鹽和碘化合物等,也對(duì)ASFV 敏感。在不同環(huán)境中,評(píng)估消毒藥的具體效果。消毒的程序也很重要,各種用具、欄舍最好是先水洗,利用洗滌劑如速清泡洗至物見本色,再用速清1:100 消毒,最后再進(jìn)行清洗后干燥;對(duì)于欄舍周圍2 m 范圍內(nèi)先將所有雜物、雜草、糞便、廢棄的用具進(jìn)行嚴(yán)格清理,防止蚊蠅滋生、雜草叢生,然后用3% ~5% 燒堿或20% 的生石灰乳進(jìn)行嚴(yán)格噴涂;對(duì)生產(chǎn)區(qū)的道路、欄舍過道和護(hù)欄等先進(jìn)行清掃、水洗和干燥,然后用3% ~5% 的燒堿、20% 的生石灰如噴灑路面或過道、墻壁等。消毒的頻率和強(qiáng)度也要把控好,既要達(dá)到徹底消毒的目的、又要防止過度消毒,避免對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)外環(huán)境的生態(tài)造成嚴(yán)重破壞,如對(duì)水源和土壤的嚴(yán)重污染。對(duì)風(fēng)險(xiǎn)區(qū)、道路、走道、護(hù)欄和耐燃用具等用火焰消毒,是一種非常安全、有效的消毒方式;對(duì)飼料庫房、藥品儲(chǔ)存室、實(shí)驗(yàn)室和空欄等也可以采用熏蒸消毒。沒有感染的豬場(chǎng)嚴(yán)禁帶豬消毒和飼料消毒,因?yàn)閹жi消毒、飼料消毒可能破壞豬的第一道皮膚屏障、消化道和呼吸道黏膜屏障等,加快ASFV 的傳播速度。
2.1.2 建立有效的隔離屏障和緩沖帶,有利于阻擋ASFV 入侵豬場(chǎng)
有許多安全等級(jí)非常高的豬場(chǎng),也感染了非洲豬瘟,并且逐步提高安全等級(jí)也無法幸免,這一點(diǎn)讓養(yǎng)豬人感覺到非常恐怖。這是怎么一回事?讓人無法理解。但細(xì)想一下,再完善的生物安全和消毒措施都有漏洞,所謂 “百密一疏” 嘛!同時(shí)單純的打打殺殺也不是一個(gè)事,即使每天都對(duì)豬場(chǎng)的每一個(gè)角落都進(jìn)行徹底消毒,其實(shí)也做不到100% 殺死細(xì)菌和病毒,只要有移動(dòng)的媒介存在就有可能把新的病毒帶入豬場(chǎng)。而移動(dòng)的媒介如蒼蠅與蚊子、老鼠、飛鳥甚至是一陣風(fēng)也可能把新病毒帶入豬場(chǎng),更不用說飛馳的車輛(五類車:拉豬車、拉料車、拉糞車、私家車、無公害處理車)、移動(dòng)的人(五類人:殺豬人、拉豬人、養(yǎng)豬人、豬場(chǎng)主、獸醫(yī))、移動(dòng)的掃帚和高壓的清洗槍等。在南方來說,即使你做得再好,一場(chǎng)雨就可以使你的所有努力全部都白費(fèi)。因此,有必要在豬場(chǎng)周圍建立起一個(gè)有效的隔離屏障和緩沖帶,如筑高墻,修建一個(gè)至少2 m高圍繞整個(gè)豬場(chǎng)的隔離圍墻,同時(shí)在高墻內(nèi)外各修建一個(gè)2 m 寬的隔離帶,可以有效阻擋大部分病毒進(jìn)入豬場(chǎng),因?yàn)锳SFV 沒長(zhǎng)腿走不過2 m,也沒有長(zhǎng)翅膀飛不過2 m。清除所有雜草、處理所有雜物,防止蚊蠅滋生,并對(duì)高墻和內(nèi)外隔離帶嚴(yán)格進(jìn)行的消毒處理,同時(shí)在高墻外圍鋪上1 m 寬的尖碎石防止老鼠進(jìn)入豬場(chǎng),還要防止雨水往豬場(chǎng)內(nèi)流動(dòng),只允許水往外流。
2.2.1 維護(hù)豬消化道和呼吸道完整有利于防控非洲豬瘟
黏膜免疫在非洲豬瘟防控上也發(fā)揮重要的作用。黏膜系統(tǒng)是機(jī)體與外界直接接觸、病原體侵入的門戶,而非洲豬瘟侵入的門戶首選呼吸道和消化道,因此,維護(hù)消化道、呼吸道黏膜的完整、維護(hù)共同黏膜免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能完整非常關(guān)鍵。不同部位黏膜免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)形成共同黏膜免疫屏障(CMIS)。SIgA 作用于黏膜局部,是黏膜中關(guān)鍵因子,對(duì)維護(hù)黏膜上皮細(xì)胞之間的緊密連接,對(duì)由于食物攝入或由空氣吸入的某些抗原物質(zhì)具有封閉作用;SIgA 與病毒結(jié)合,可阻擋病毒粘附于宿主細(xì)胞、中和病毒和病毒產(chǎn)生的毒素,增加黏液蛋白酶對(duì)抗原降解等免疫清除作用,避免抗原進(jìn)入機(jī)體,從而避免某些超敏反應(yīng)發(fā)生。SIgA 所具有的超高產(chǎn)量、超高免疫清除率,超出了其他所有Ig,能有效防御疾病、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和防止某些超敏反應(yīng)與自身免疫病。ASFV 通過鼻、口侵入呼吸道和消化道黏膜后,引發(fā)黏膜炎癥,SIgA 由SC 介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)到消化道、呼吸道和泌尿生殖道,應(yīng)防止轉(zhuǎn)運(yùn)SIgA 的能力下降,造成CMIS 受損。因此,維護(hù)消化道和呼吸道完整有利于防控非洲豬瘟。
飼料熟化對(duì)非洲豬瘟防控的效果需要進(jìn)一步的研究與評(píng)估,但飲水的酸化有利于防控非洲豬瘟。有人在大談特談?lì)w粒熟化料一定比自配料安全,討論85 ℃ 3 min、10 min 和20 min 熟化哪個(gè)更安全?要說飼料的安全問題,作者的觀點(diǎn)是自配料更安全,主要有這幾個(gè)方面的原因:1)自配料現(xiàn)配現(xiàn)用,營養(yǎng)物質(zhì)的損耗相對(duì)來說比較小,生產(chǎn)過程和原材料質(zhì)量比較好把控,可以杜絕豬源性動(dòng)物蛋白如血粉、腸膜蛋白和肉骨粉等使用;2) 自配料的原料粉碎粒徑比較大,一般不會(huì)引發(fā)豬的胃潰瘍和嘔吐現(xiàn)象,而從實(shí)際使用顆粒料飼喂母豬的情況來看,嘔吐現(xiàn)象比較多見,這與顆粒料原料粉碎粒徑過細(xì)容易誘發(fā)胃潰瘍有一定關(guān)系;3)長(zhǎng)期飼喂顆粒料的母豬容易發(fā)生便秘,而便秘對(duì)于防控非洲豬瘟是極為不利的;4)長(zhǎng)期飼喂顆粒料更容易引發(fā)代謝紊亂,特別在非洲豬瘟防控的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上,飼料要在倉庫放置一個(gè)月的時(shí)間會(huì)比較安全,這樣自配料就有優(yōu)勢(shì),我們可以考慮將原材料放置一個(gè)月時(shí)間,而不是把飼料放置一個(gè)月時(shí)間,而顆粒料的保質(zhì)期一般為45 d,對(duì)于一些氧化活性成分如維生素、抗氧化劑、脂肪等長(zhǎng)期保存有巨大的挑戰(zhàn)。飼料熟化再加上放置一定時(shí)間,飼料中維生素的破壞或損耗可能比較大,因此,長(zhǎng)期飼喂這樣的飼料有可能引發(fā)非常嚴(yán)重的代謝紊亂;5)顆粒料由于熟化的原因,往往在飼喂過程中更容易招蚊子,根據(jù)目前的流行病學(xué)調(diào)查來看,蒼蠅、蚊子有傳播非洲豬瘟病毒的風(fēng)險(xiǎn)。從以上情況來看,飼料熟化可能加重了豬消化道和呼吸道的破壞,增加了其炎癥,對(duì)非洲豬瘟防控極為不利,臨床觀察到一些豬場(chǎng)飼喂豬顆粒料發(fā)生非洲豬瘟情況要多一些,也可以為證。凡是造成豬黏膜損傷的因素,必將對(duì)非洲豬瘟防控產(chǎn)生不利影響。
2.2.2 提高機(jī)體的非特異性免疫功能,有利于提高豬的抗ASFV 感染閾值
ASF 屬于免疫亢奮性疾病,機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬能力越強(qiáng)、體液免疫產(chǎn)生抗體的能力愈大,病毒的復(fù)制、病毒血癥和Ⅲ型超敏反應(yīng)愈強(qiáng)烈,病豬的發(fā)病和死亡更快。ASFV 在宿主細(xì)胞內(nèi)建立起各種各樣的逃避機(jī)制來規(guī)避和操縱宿主免疫應(yīng)答的能力,由于病毒顆粒比較大,吸引巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用感染豬。在抗體和補(bǔ)體共同作用下促進(jìn)了其吞噬作用,形成了細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒和細(xì)胞外病毒顆粒。ASFV 通過干擾Th1 細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ,限制了感染巨噬細(xì)胞的活化、抑制其凋亡和自噬作用,不讓巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒活性并在其周圍吸附大量紅細(xì)胞,確保其存活與加快病毒復(fù)制增殖,還阻礙來支援的淋巴細(xì)胞。被感染的細(xì)胞被血液和淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)至扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟和骨髓等處產(chǎn)生免疫應(yīng)答,產(chǎn)生大量非中和抗體,感染后4 ~8 d 往往出現(xiàn)持續(xù)性的病毒血癥;即使有了中和抗體,其與補(bǔ)體一道也只能識(shí)別并中和細(xì)胞外游離的病毒顆粒,而對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒或已開始復(fù)制的病毒則完全無效。持續(xù)性的病毒血癥與微血管內(nèi)皮細(xì)胞堆積大量可溶性抗原抗體復(fù)合物,引發(fā)Ⅲ型超敏反應(yīng)。病毒隨著體液、血液排到環(huán)境中,病豬成為了活動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)源,排毒可持續(xù)63 ~70 d。
ASFV 的滅活苗對(duì)防控非洲豬瘟無效。主要是因?yàn)闇缁钜呙绺嗟丶せ頣h2 型體液免疫應(yīng)答、提高抗體滴度。Th2 細(xì)胞分泌IL-4,不分泌IL-2 及IFN-γ,加快病毒的復(fù)制、持續(xù)性病毒血癥和微循環(huán)障礙,引發(fā)局部組織水腫、壞死、瘀血、大出血和快速死亡。因而組織滅活苗對(duì)非洲豬瘟防控不但沒有控制作用,反而會(huì)加快病毒的傳播、加快生豬死亡。其致死的主要機(jī)理,是ASFV 感染豬肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞的活化造成肺泡水腫,血液回流受阻,血液中氧氣被耗竭而嚴(yán)重缺氧死亡。
在非洲豬瘟防控上,非特異性免疫或細(xì)胞免疫應(yīng)答占主導(dǎo),如大豬的胸腺萎縮或保育豬藍(lán)耳病不穩(wěn)定加速了胸腺功能的退化,無法產(chǎn)生足量的T 細(xì)胞或有活性的T 細(xì)胞,細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(CTL)多為CD8+T 細(xì)胞,通過來攻擊被ASFV感染的細(xì)胞膜,釋放穿孔素、顆粒酶攻擊靶細(xì)胞形成跨膜孔道,引起細(xì)胞破裂而死亡;還攻擊感染細(xì)胞的胞核,通過活化核酸酶,破壞靶細(xì)胞和病毒DNA,同歸于盡而凋亡(即程序性死亡)。Th1 細(xì)胞針對(duì)細(xì)胞內(nèi)入侵的宿主細(xì)胞誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生,分泌IL-2、IFN-γ( Ⅱ型,遇酸變性) 及IFN-β(I 型,遇酸穩(wěn)定),不分泌IL-4,主要參與細(xì)胞免疫及炎癥反應(yīng),抗病毒、抗胞內(nèi)寄生菌等作用,為易感染動(dòng)物的早期保護(hù)提供幫助。
總之,在非洲豬瘟防控方面,維護(hù)胸腺功能防止胸腺過早退化、提高T 細(xì)胞和SIgA 的活性、維護(hù)呼吸道和消化道黏膜的完整可有效提高豬的感染閾值,同時(shí)也需要通過嚴(yán)格的生物安全來降低環(huán)境病毒載量,只有雙管齊下,才能有效防控非洲豬瘟。