張秀華，路偉，蘇瑋瑋，李淑芬

（華威特（江蘇）生物制藥有限公司，泰州 225300）

牛呼吸道合胞體病是由牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus, BRSV）引起的一種急性、熱性傳染病。該病以發(fā)熱、流淚、流鼻液、流涎、呼吸急迫、咳嗽、乳牛泌乳量顯著下降和嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎等為主要特征。1967年，Paccaud和Jacquier在瑞士首次從牛體內(nèi)分離到BRSV。日本、比利時(shí)、英國(guó)、加拿大和美國(guó)等國(guó)也相繼分離出該病毒。北美BRSV特異性抗體陽(yáng)性牛達(dá)81%，美國(guó)南部地區(qū)BRSV的血清陽(yáng)性率要高于北部地區(qū)。在美國(guó)，呼吸疾病患牛的死亡率達(dá)到13%。在加拿大，BRSV的總感染率將近36%。墨西哥的兩個(gè)不同地區(qū)感染率分別達(dá)52%和90.8%。瑞典牛奶中BRSV抗體的檢出率高達(dá)41%～89%。丹麥、比利時(shí)、英國(guó)等國(guó)家也都有BRSV感染的報(bào)道，且發(fā)病率也較高。埃塞俄比亞和南非的BRSV感染發(fā)病率也較高。其他國(guó)家，如土耳其也有較高的血清陽(yáng)性率（達(dá)43%）[1]。2007年，王紅等從國(guó)內(nèi)發(fā)生牛呼吸道病的某牛場(chǎng)分離出BRSV[2]，說明BRSV感染在國(guó)內(nèi)也是存在的，但尚無較大規(guī)模的血清流行病學(xué)研究報(bào)告。BRSV可以感染各年齡段的牛、綿羊、山羊及其他易感動(dòng)物，大多數(shù)為無癥狀感染[3]，而且BRSV可通過再次感染或攜帶者在畜群中持續(xù)存在，導(dǎo)致治療費(fèi)用不斷增加。

1 診斷方法

1.1 病毒分離與鑒定

動(dòng)物病死后的病料不易分離到病毒，發(fā)病牛的氣管或者肺臟的沖洗液、病牛鼻腔深部的鼻液可作為病毒分離的病料。常用細(xì)胞有猴腎（Vero）細(xì)胞、牛腎（MDBK）細(xì)胞和牛鼻甲細(xì)胞系（BT），其中BT細(xì)胞對(duì)該病毒最敏感，適于作為分離和培養(yǎng)病毒之用。BRSV在牛鼻甲細(xì)胞上可形成其獨(dú)特、可見的合胞體及胞漿包涵體[3]。BRSV對(duì)熱及惡劣環(huán)境敏感，表現(xiàn)不穩(wěn)定，在運(yùn)輸過程中極易失活。同其他病毒分離一樣，BRSV的分離被認(rèn)為是診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但是病毒分離一般需要數(shù)個(gè)星期，而且陽(yáng)性率低、成本高，進(jìn)一步鑒定還需要免疫熒光或者分子生物學(xué)方法檢測(cè)，因此，不適用于臨床早期診斷和疫情應(yīng)急診斷。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)對(duì)牛呼吸道合胞體病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查均具有重要意義。目前，應(yīng)用最多的有血清中和試驗(yàn)（SNT）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。

1.2.1 血清中和試驗(yàn)（SNT）

SNT是經(jīng)典的血清學(xué)檢測(cè)方法。該試驗(yàn)的周期需要1周左右，而且操作繁瑣，所以很少用于臨床疾病的快速診斷，且無法診斷人工免疫后的動(dòng)物[4]。應(yīng)用抗BRSV陽(yáng)性血清進(jìn)行SNT，往往可以確定待檢的樣本是否為BRSV，并且新檢測(cè)方法的建立都將SNT作為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，并與SNT進(jìn)行比較以確定新檢測(cè)方法的敏感性。

1.2.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）

CFT是用免疫溶血機(jī)制作為指示系統(tǒng)來檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)抗原或抗體的試驗(yàn)。Bostandzhieva等采用CFT對(duì)240份血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出40份血清為陽(yáng)性，感染率為18%，證明了該方法對(duì)疾病的檢測(cè)有效。但此方法在國(guó)內(nèi)外診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用得很少。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)（IFA）

IFA是目前應(yīng)用較廣泛的BRSV快速檢測(cè)技術(shù)，其原理是用熒光素標(biāo)記的抗體和相應(yīng)抗原形成免疫復(fù)合物，借助熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)病毒抗原及其存在的位置。將IFA用于自然感染牛和試驗(yàn)感染牛鼻咽上皮細(xì)胞中BRSV抗原的檢測(cè)，但未能獲得滿意結(jié)果。Quinting等建立了一種間接免疫熒光法檢測(cè)發(fā)病牛器官勻漿液中的BRSV抗原，整個(gè)檢測(cè)只需1.5h，與Real-time RT-PCR法相比，該方法更敏感和特異。IFA檢測(cè)的病料（如肺臟及氣管組織等）必須是新鮮或速凍的病料，因?yàn)樵诟栺R林等化學(xué)品固定的病料中，BRSV抗原往往受到較大的破壞，診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性有所降低[5]。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是一項(xiàng)已在動(dòng)物疫病診斷工作中得到廣泛應(yīng)用的血清學(xué)診斷技術(shù)。由于酶的高效催化作用使其對(duì)抗原抗體結(jié)合識(shí)別起到了放大作用，從而達(dá)到了快速、靈敏、高效的檢測(cè)要求，是一種重要的疫病早期診斷方法[4]。ELISA適合檢驗(yàn)大批標(biāo)本和微量標(biāo)本，被列為診斷BRSV感染的常規(guī)檢測(cè)方法。目前國(guó)際上用于檢測(cè)BRSV抗體的間接ELISA診斷方法主要針對(duì)的是BRSV的N蛋白、F蛋白和G蛋白。N蛋白具有良好的穩(wěn)定性和特異性，常被用于包被抗原，進(jìn)而建立診斷BRSV抗體的有效方法。目前利用純化的BRSV為抗原建立了檢測(cè)牛奶和血清中BRSV抗體的間接ELISA方法，結(jié)果表明該方法快速可靠。有學(xué)者使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)BRSV N蛋白，并以此重組N蛋白為抗原建立了間接ELISA診斷方法，對(duì)感染牛血清進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。此外，也有使用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)的F蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)BRSV血清抗體的間接ELISA方法的。與SNT相比較，該方法快速、敏感、特異。利用G蛋白建立的間接G-ELISA診斷方法不僅比傳統(tǒng)的間接F-ELISA診斷方法更敏感，而且還可以區(qū)分亞型。馮軍科等應(yīng)用純化的重組蛋白G1為包被抗原，檢測(cè)國(guó)內(nèi)牛血清中的BRSV抗體，建立了牛呼吸道合胞體病毒G蛋白的血清學(xué)診斷方法[6]。

1.3 分子生物學(xué)方法

1.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

以特異性強(qiáng)、敏感性高、高效快速為特點(diǎn)的PCR已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的方法。該方法已廣泛用于BRSV的檢測(cè)。與病毒分離和IFA相比，PCR的結(jié)果不受標(biāo)本病毒失活的影響，也不需要完整的受感染細(xì)胞，但是PCR反應(yīng)的條件選擇非常嚴(yán)格，擴(kuò)增所用引物具有較強(qiáng)的特異性。Larsen等應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)自然和試驗(yàn)感染牛肺組織中BRSV的F基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法較敏感、可靠。Valarcher等應(yīng)用nRT-PCR方法對(duì)BRSV的N基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，適合BRSV的診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。Boxus等利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法從被感染牛的氣管和肺臟的灌洗液中檢測(cè)到BRSV，靈敏度是傳統(tǒng)RTPCR的100倍，并且能夠?qū)Ω腥?4d后的肺臟灌洗液進(jìn)行病毒定量。史鴻飛等首次用套式RT-PCR技術(shù)證實(shí)了我國(guó)部分省份牛群中存在BRSV感染[7]。

1.3.2 原位雜交技術(shù)(ISH)

ISH是將組織化學(xué)與經(jīng)典的核酸雜交技術(shù)相結(jié)合衍生出來的可定位檢測(cè)核酸分子的病理學(xué)技術(shù)，可在組織、細(xì)胞或染色體上原位檢測(cè)是否存在目的DNA或RNA片段。西班牙學(xué)者M(jìn)asot等應(yīng)用原位雜交（ISH）技術(shù)檢測(cè)了試驗(yàn)感染牛呼吸道合胞體病毒（BRSV），并檢測(cè)了不同時(shí)間內(nèi)在羔羊肺中的分布情況[8]。

1.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

LAMP是利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的技術(shù)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)可一步完成，擴(kuò)增效率高，可在15～60min擴(kuò)增109～1 010倍；所有靶基因序列的檢測(cè)可通過擴(kuò)增產(chǎn)物的有、無來判斷。有無擴(kuò)增反應(yīng)是利用添加熒光染料的熒光強(qiáng)度或利用核酸擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀反應(yīng)的沉淀濁度來判定的?？筛鶕?jù)BRSV的保守基因設(shè)計(jì)4條特異性引物，建立BRSV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，為牛呼吸道疾病的準(zhǔn)確診斷提供新的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增高效、快速、設(shè)備簡(jiǎn)單、鑒定簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適于在基層推廣和應(yīng)用。

2 防治

2.1 免疫預(yù)防

經(jīng)過幾十年的努力，BRSV疫苗的研究已取得了顯著的進(jìn)展，BRSV疫苗一般在免疫系統(tǒng)不健全和母源抗體存在時(shí)能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生具有中和活性的血清抗體和黏膜抗體。目前上市的主要有兩種疫苗：①滅活苗?？烧T導(dǎo)犢牛產(chǎn)生高水平的中和抗體，但并不能保護(hù)所有免疫牛免于感染。②弱毒苗。Kubota等報(bào)道，BRSV在低溫(30℃)條件下通過HAL繼代獲得rs-52株，用它接種犢牛，既不出現(xiàn)臨床癥狀和排毒現(xiàn)象，又能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，且抗體持續(xù)期長(zhǎng)，可有效預(yù)防BRSV感染。Xue等報(bào)道，采用多聯(lián)活疫苗（包含5個(gè)病毒抗原BVDV1、BVDV2、IBRV、PI3V和BRSV）免疫3～8日齡的小牛，免疫后與未免動(dòng)物攻毒后比較，該多聯(lián)活疫苗免疫動(dòng)物的臨床癥狀、肺部變化、白細(xì)胞和血小板減少數(shù)量大大降低，雖然大多數(shù)免疫動(dòng)物依然排毒，但是與未接種動(dòng)物相比，排毒期和排毒量大幅度降低，證明該5聯(lián)活疫苗安全有效[9]。而Taylor報(bào)道，人呼吸道合胞體病毒對(duì)溫度敏感的突變株ts-1雖然對(duì)牛的毒力明顯減弱，但不能完全保護(hù)犢牛免于BRSV感染[10]。

近年的研究表明，有效的副黏病毒疫苗能誘導(dǎo)針對(duì)病毒表面糖蛋白的抗F、G抗體的產(chǎn)生，尤其是抗F抗體，這為研制BRSV的生物技術(shù)疫苗提供了重要依據(jù)。目前已研制了用牛皰疹病毒作載體表達(dá)BRSV的G蛋白重組疫苗，可誘導(dǎo)黏膜免疫使牛得到保護(hù)。采用重組牛痘病毒表達(dá)的F蛋白免疫小牛能夠產(chǎn)生IgG抗體和誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，不能產(chǎn)生IgE抗體，同時(shí)該疫苗能夠抵抗BRSV的攻擊[11]。

BRSV感染或者疫苗接種所產(chǎn)生的免疫力時(shí)間很短，可能僅能持續(xù)3～4個(gè)月，其原因目前尚不清楚，但是可以解釋BRSV發(fā)生頻繁甚至反復(fù)感染免疫動(dòng)物和非免疫動(dòng)物的原因。因此，頻繁的免疫能夠控制該病的發(fā)生。懷孕母畜接種BRSV病毒活疫苗是安全的，且能夠?qū)⒛冈纯贵w轉(zhuǎn)移給小牛。有證據(jù)表明，具有母源抗體的小牛接種疫苗易產(chǎn)生免疫應(yīng)答。用含有BRSV抗原的三聯(lián)滅活疫苗免疫哺乳小牛，抗原能夠沖破母源抗體干擾產(chǎn)生免疫保護(hù)，推測(cè)二免后抗體水平將更高[12]。

值得注意的是，大多數(shù)情況下BRSV并不是獨(dú)立存在的，它往往與其他的牛傳染性呼吸道致病原同時(shí)感染牛，造成典型的“運(yùn)輸熱”或“干草熱”。這些致病原包括牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、傳染性牛鼻氣管炎病毒（IBR）、牛副流感病毒3型（PI-3）、牛呼吸道冠狀病毒（rBCoV）、溶血性巴氏桿菌以及牛支原體等。試驗(yàn)證明，與其他病原共同感染的BRSV對(duì)牛造成的臨床疾病更嚴(yán)重。因此，有效地防控其他病原，也是有效防控BRSV感染的必要條件。

2.2 治療

牛呼吸道合胞體病目前沒有特效療法，只能采取對(duì)癥治療。發(fā)生BRSV感染的牛經(jīng)常表現(xiàn)脫水，需要補(bǔ)充水分和電解質(zhì)；另外，被感染牛易繼發(fā)感染溶血性巴氏桿菌、壞死性巴氏桿菌以及牛支原體等，可直接采用廣譜的抗生素防止細(xì)菌繼發(fā)感染，采用皮質(zhì)類固醇藥物控制過敏反應(yīng)等。短期使用皮質(zhì)類固醇藥物可以緩和呼吸困難的癥狀，但是該藥物有免疫抑制作用，能夠加重牛呼吸道合胞體病的病情和繼發(fā)感染，因此在使用皮質(zhì)類固醇藥物時(shí)要慎重，如果不是急性癥狀，勿輕易使用。

2.3 綜合措施

每日及時(shí)清理牛舍地面及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的糞便，同時(shí)對(duì)地面、用具、工作服等嚴(yán)格消毒。經(jīng)常觀察牛群，發(fā)現(xiàn)病牛應(yīng)立即隔離或淘汰。對(duì)外界引進(jìn)的牛只，一律采取隔離、檢疫措施，確診無病才能入群。對(duì)于受威脅的牛，應(yīng)全面接種疫苗，以預(yù)防本病發(fā)生。另外，減少小牛特別是易感小牛與成年牛的接觸是簡(jiǎn)單有效的控制手段。