結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，也是我國(guó)重點(diǎn)防控的重大傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計(jì)，2017年我國(guó)結(jié)核病患者數(shù)居世界第2位，耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant TB，MDR-TB)/耐利福平結(jié)核病(rifampicin resistant tuberculosis， RR-TB)負(fù)擔(dān)居世界第2位[1]，結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病對(duì)我國(guó)如期完成“終止結(jié)核病流行目標(biāo)”是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。因此，加強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究尤其重要。

異煙肼和利福平是治療結(jié)核分枝桿菌感染最重要的2個(gè)首選藥物，二者均存在價(jià)格便宜、殺菌力強(qiáng)和副作用低的特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)主要集中在MDR-TB、 RR-TB以及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB，指MDR菌株同時(shí)對(duì)一種氟喹諾酮類藥物和3種二線注射類藥物中的一種或多種耐藥)上。然而，由于異煙肼的耐藥機(jī)制更為復(fù)雜，其研究和快速分子診斷難度更大。筆者將在本文中從異煙肼耐藥的流行狀況、耐藥機(jī)制以及耐藥性的檢測(cè)方法等方面討論，以期給異煙肼耐藥結(jié)核病的防控一點(diǎn)提示。

1 結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的流行情況

異煙肼由Meyer和Mally于1912年在布拉格首次合成[2]，1952年分別被美國(guó)、德國(guó)的2個(gè)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)具有抗結(jié)核活性，從此用于抗結(jié)核治療[3]。在20世紀(jì)50年代早期，異煙肼主要作為單藥治療結(jié)核病，后因觀察到單藥使用容易導(dǎo)致異煙肼耐藥性快速發(fā)生，從而導(dǎo)致了多藥聯(lián)合化療方案的出現(xiàn)。

WHO于2014年的全球結(jié)核病報(bào)告中首次報(bào)道了利福平敏感菌株的異煙肼耐藥率，根據(jù)154個(gè)國(guó)家1995-2013年報(bào)告的數(shù)據(jù)估計(jì)初治患者為8.1%，復(fù)治患者為14.0%[4]；2018年WHO報(bào)告，根據(jù)146個(gè)國(guó)家2003-2017年的數(shù)據(jù)估算該結(jié)果有所下降，初治結(jié)核患者為7.1%，復(fù)治患者為7.9%[1]。2018年WHO報(bào)告的利福平敏感菌株的異煙肼耐藥率與2017年全球的MDR/RR耐藥率相比，初治患者中前者明顯高于后者(7.1%vs3.5%)；但復(fù)治患者前者明顯低于后者(7.9%vs18%)[1, 4]。Yuen[5]通過(guò)對(duì)32個(gè)國(guó)家和地區(qū)的兒童結(jié)核病患者進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：兒童結(jié)核病患者中異煙肼耐藥率高達(dá)12.1%，且大部分集中在西太區(qū)和東南亞地區(qū)。由此可看出，異煙肼耐藥結(jié)核病在全球范圍內(nèi)處于一個(gè)比較嚴(yán)重的流行狀態(tài)。

我國(guó)的結(jié)核病異煙肼耐藥疫情也處于一個(gè)較嚴(yán)重的狀態(tài)。根據(jù)我國(guó)2007-2008年開(kāi)展的全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示，初治患者異煙肼總耐藥率為16.01%，在6種檢測(cè)藥物中位列第2，明顯高于利福平總耐藥率(6.65%)；復(fù)治患者異煙肼總耐藥率為38.51%，在6種檢測(cè)藥物中位列第1，明顯高于利福平總耐藥率(29.40%)[6]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)多個(gè)省市的初治患者中異煙肼耐藥率均高于利福平耐藥率，如杭州市11.22%vs5.19%[7], 浙江省江山市13.7%vs4.3%[8]，廣東省8.30%vs3.86%[9]。

異煙肼是結(jié)核病控制中一個(gè)非常重要的藥物，該藥便宜、有效而且副反應(yīng)少，目前它的地位不可替代。異煙肼不僅對(duì)繁殖期的結(jié)核分枝桿菌具有殺菌作用，對(duì)靜止期的結(jié)核分枝桿菌同樣具有殺菌作用，因此除了治療活動(dòng)性結(jié)核病外，還常用于治療結(jié)核分枝桿菌隱性感染，而且是少有的能通過(guò)血腦屏障的抗結(jié)核藥物之一。因此，對(duì)異煙肼耐藥的問(wèn)題必須引起重視。Menzies D等人[10]在Meta分析文章中綜述：對(duì)臨床治療方案進(jìn)行校正后初始異煙肼耐藥患者治療失敗和復(fù)發(fā)的發(fā)生率均明顯大于全敏患者[OR值分別為10.9(95%置信區(qū)間為5.9-20)和1.8(95%置信區(qū)間為1.2-2.6)]。此外，多個(gè)地方的觀察性研究[11-12]也報(bào)道了類似的結(jié)果。

由于利福平表型和基因型耐藥的高度相關(guān)性以及GenXpert等分子檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)使得RR-TB的快速檢測(cè)成為可能，加上利福平在結(jié)核病防控中的重要性，RR-TB快速引起結(jié)核病防控領(lǐng)域的重視。然而，Smith等[13]對(duì)WHO多年報(bào)告的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在一些MDR患病率較低的國(guó)家和地區(qū)約有40%的利福平耐藥患者沒(méi)有對(duì)異煙肼耐藥，他們認(rèn)為檢測(cè)異煙肼耐藥性是非常必要的。中國(guó)地域遼闊，各個(gè)省市結(jié)核病控制水平有差異，在強(qiáng)調(diào)利福平耐藥危險(xiǎn)性或者說(shuō)重要性的基礎(chǔ)上，對(duì)異煙肼耐藥的重要性問(wèn)題有必要進(jìn)一步探討。

2 基因突變與結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥的關(guān)系

異煙肼作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。目前主要認(rèn)為異煙肼進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌后首先被過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶(catalase-peroxidase, KatG)還原成具有殺菌活性的異煙酸，異煙酸與烯?；d體蛋白InhA相結(jié)合，從而阻斷細(xì)胞壁分枝菌酸的合成而發(fā)揮殺菌作用。據(jù)報(bào)道，katG和inhA啟動(dòng)子突變是結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼產(chǎn)生耐藥的主要原因，然而科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥的機(jī)制更為復(fù)雜，耐藥相關(guān)基因突變與表型、治療結(jié)局的關(guān)系需進(jìn)一步闡明[14-18]。通常認(rèn)為katG突變與結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼高水平耐藥相關(guān)，inhA啟動(dòng)子突變與異煙肼低水平耐藥相關(guān)。katG基因突變株約占異煙肼耐藥菌株的50%～75%；inhA啟動(dòng)子突變約占10%～20%左右；oxyR-ahpC間隔區(qū)突變約占5%～10%，排在第3位，屬于katG耐藥性突變引起的代償性突變[14-16]。值得注意的是，近年來(lái)一直認(rèn)為與乙胺丁醇耐藥性相關(guān)的embB基因突變同時(shí)被認(rèn)為與異煙肼耐藥性相關(guān)[17-18]。此外，目前發(fā)現(xiàn)還有18個(gè)基因與之有關(guān)[17]。

3 異煙肼耐藥對(duì)多藥耐藥的影響

異煙肼耐藥重要與否及其重要性如何，假設(shè)異煙肼耐藥像利福平耐藥是MDR的重要預(yù)兆因子，那么控制異煙肼耐藥是非常重要的。據(jù)報(bào)道80%的利福平耐藥株同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥，因此利福平耐藥被看作是MDR的一個(gè)主要標(biāo)志[19]。如此，從基因進(jìn)化的角度理解，應(yīng)是菌株先獲得利福平耐藥性，然后快速累積異煙肼耐藥相關(guān)基因突變，從而發(fā)生異煙肼耐藥。然而事實(shí)并非如此，多個(gè)地方的研究表明異煙肼耐藥率明顯高于利福平耐藥率[6, 20]，顯然多數(shù)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性獲得提前于利福平。Mannson等[21]通過(guò)對(duì)來(lái)自5個(gè)洲的5 310株結(jié)核分枝桿菌基因組進(jìn)行分析以后發(fā)現(xiàn)不同家系、不同地區(qū)和不同年代的MDR菌株中約有96%其獲得異煙肼耐藥性先于利福平耐藥性，只有4%的MDR菌株其異煙肼耐藥性是在利福平耐藥的基礎(chǔ)上后獲得的。Hu等[22]也發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥性尤其是katG315突變更容易誘發(fā)菌株對(duì)利福平耐藥而形成耐多藥菌株。2009年menzis等[10]在其對(duì)臨床相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析的綜述中檢驗(yàn)了異煙肼耐藥性是否會(huì)增加其它藥物耐藥性獲得的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥組獲得性耐藥的發(fā)生率是異煙肼敏感組的5.1倍 (95%置信區(qū)間: 2.3-11.0) 。還有多個(gè)觀察性研究[23-27](未設(shè)立敏感對(duì)照組)認(rèn)為異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)展為MDR的可能性在1%～10%之間。我國(guó)也有相關(guān)研究報(bào)道，同樣采用含異煙肼和利福平的方案治療，單耐異煙肼患者比單耐利福平肺結(jié)核患者更容易發(fā)展成耐多藥肺結(jié)核[28]。利用基因組數(shù)據(jù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌群體水平上獲得的相關(guān)基因突變構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)異煙肼耐藥相關(guān)基因突變提前利福平耐藥相關(guān)基因突變3～30年之間[29-31]。

4 結(jié)核分枝桿菌從異煙肼耐藥到多藥耐藥的可能機(jī)制

4.1外排泵機(jī)制 外排泵是一類與細(xì)菌生理活動(dòng)和物質(zhì)代謝密切有關(guān)的膜蛋白，其在結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗生素的耐藥中也發(fā)揮了重要的作用。外排泵引起的耐藥具有泛耐藥性、可誘導(dǎo)性和低耐藥性的特點(diǎn)。2012年，Machado等[32]報(bào)道利福平單耐藥菌株以及H37Rv經(jīng)異煙肼誘導(dǎo)后，異煙肼耐藥水平升高，并引起katG438位密碼子突變和katG的缺失，RT-qPCR顯示mmpL7，p55，efpA，mmr，Rv1258c和Rv2459等外排泵基因的表達(dá)水平明顯升高。此外，還有2個(gè)研究報(bào)告異煙肼誘導(dǎo)(亞抑菌濃度)培養(yǎng)菌株后，會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)異煙肼耐藥、異煙肼耐藥相關(guān)基因突變，多個(gè)外排泵基因高表達(dá)[33-34]。Colangeli等人[35-36]報(bào)道外排泵IniBAC與異煙肼和乙胺丁醇的耐藥有關(guān),該外排泵系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Lsr2的調(diào)節(jié)。盡管通常認(rèn)為外排泵對(duì)底物無(wú)特異性，但有文獻(xiàn)報(bào)道并不是當(dāng)前應(yīng)用中的抗生素都可被認(rèn)為是外排泵的底物[37]，而且Li等[38-39]分別用異煙肼和利福平誘導(dǎo)各自的單耐藥菌株后發(fā)現(xiàn),前者誘導(dǎo)高表達(dá)的外排泵個(gè)數(shù)高于后者(14>8)(共檢測(cè)35個(gè))。以上證據(jù)表明異煙肼在結(jié)核分枝桿菌中容易誘發(fā)多種外排泵的表達(dá)。由于結(jié)核病治療療程長(zhǎng)達(dá)6～24月且采用聯(lián)合化療方案，因此筆者推測(cè)異煙肼誘導(dǎo)外排泵過(guò)表達(dá)后，這些高表達(dá)的外排泵同時(shí)也將其它藥物排出菌體外，間接形成細(xì)菌長(zhǎng)期接觸的藥物濃度低于殺菌濃度的環(huán)境，有可能使結(jié)核分枝桿菌先對(duì)其它藥物低耐藥，接著產(chǎn)生耐藥相關(guān)基因的突變致耐藥表型的出現(xiàn)，其具體機(jī)制如何有待進(jìn)一步研究。

4.2其它機(jī)制 Sherman等人[40]和Zhang 等人[41-42]首先發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，異煙肼進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌后需經(jīng)氧化應(yīng)激蛋白KatG和AhpC的作用才能發(fā)揮其活性作用。上文中提到耐多藥外排泵蛋白調(diào)節(jié)系統(tǒng)Lsr2通過(guò)調(diào)節(jié)外排泵的表達(dá)影響異煙肼及其它藥物的耐藥性，多個(gè)研究還發(fā)現(xiàn)Lsr2可以保護(hù)結(jié)核分枝桿菌免受氧化應(yīng)激的影響，氧化應(yīng)激與多種抗生素耐藥相關(guān)[43-44]。因此，異煙肼耐藥菌株的抗氧化應(yīng)激水平可能會(huì)影響到其它藥物的耐藥性。Saunders等人[45]認(rèn)為異煙肼耐藥性能夠促使利福平耐藥性產(chǎn)生而導(dǎo)致MDR的出現(xiàn)是因?yàn)槔Ｆ疆a(chǎn)生的選擇壓力小于異煙肼，導(dǎo)致利福平耐藥株容易被異煙肼殺死，而異煙肼耐藥株被利福平殺死相對(duì)較難，因此異煙肼耐藥株能夠存活并在標(biāo)準(zhǔn)治療方案藥物刺激下獲得額外藥物耐藥性。

5 異煙肼耐藥性的檢測(cè)方法

目前臨床上用于檢測(cè)異煙肼耐藥性的方法主要分為兩類，一類是表型檢測(cè)方法，一類為分子生物學(xué)檢測(cè)方法。表型檢測(cè)方法包括基于羅氏培養(yǎng)基的絕對(duì)濃度法和比例法，快速培養(yǎng)法以及微孔板法[46]。傳統(tǒng)方法可以直接得到結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的敏感性，方法可靠、技術(shù)成熟，缺點(diǎn)是需要細(xì)菌純培養(yǎng)物、檢測(cè)周期長(zhǎng)，值得一提的是最近幾年應(yīng)用逐漸廣泛的微孔板法由于缺乏密封性對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和設(shè)備的生物安全要求、實(shí)驗(yàn)室人員的操作技能和生物安全意識(shí)要求較高，筆者認(rèn)為如果無(wú)法對(duì)單個(gè)反應(yīng)板進(jìn)行密封，也應(yīng)該對(duì)多個(gè)板形成一個(gè)組合進(jìn)行密封。分子生物學(xué)方法基于其原理，主要有反向雜交法、基因芯片法、溶解曲線法等[46]，均建立在異煙肼耐藥相關(guān)基因突變的基礎(chǔ)上，因此其敏感性和特異性均受到人們對(duì)異煙肼耐藥機(jī)制認(rèn)識(shí)的限制，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)異煙肼耐藥機(jī)制的研究，以建立一種簡(jiǎn)單快速和可靠的藥敏檢測(cè)方法為臨床用藥提供幫助。

6 總 結(jié)

國(guó)內(nèi)外異煙肼耐藥性的流行及其帶來(lái)的危害均是較嚴(yán)重的問(wèn)題，但是否重要主要受當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病耐藥性負(fù)擔(dān)的影響，筆者雖然不推薦減少對(duì)MDR、RR或者XDR-TB的研究和重視，但是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到異煙肼耐藥同樣是不容忽視的問(wèn)題，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)異煙肼作用機(jī)制、耐藥機(jī)制、協(xié)同作用機(jī)制以及快速檢測(cè)耐藥性方面的研究。