李華敏，孫舒揚(yáng)*，黃萍萍，孫雪梅，車長遠(yuǎn)，劉文麗

（魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺 264025）

櫻桃色澤鮮艷、味道鮮美、營養(yǎng)豐富且具有藥用價(jià)值，但是隨著引種栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，鮮櫻桃已出現(xiàn)供過于求的局面。由于櫻桃的采摘期短，皮薄汁多，不易保存，因此極易造成鮮果的積壓與腐敗，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失每年達(dá)上億元[1-2]。將櫻桃釀制成櫻桃酒是解決上述難題的有效途徑。櫻桃酒富含礦物質(zhì)、維生素和多酚等保健成分，具有促進(jìn)血液循環(huán)、改善機(jī)體代謝、提高心腦血管功能等功效，符合國家倡導(dǎo)的“壓縮糧食酒，發(fā)展水果酒”政策，也符合消費(fèi)者追求天然、酒精度低、有益于健康的果酒趨勢[3-4]。

香氣是決定櫻桃酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，是多種揮發(fā)性化合物相互作用的結(jié)果，也是吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場競爭力的重要因素[5-7]。香氣的主要來源包括櫻桃品種、微生物代謝發(fā)酵以及陳釀[8]。發(fā)酵香氣是櫻桃酒香氣構(gòu)成中最重要的因素，需要多種酵母菌株（包括釀酒酵母和產(chǎn)香酵母）的參與。產(chǎn)香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，是一類能產(chǎn)生揮發(fā)性香味物質(zhì)的非釀酒酵母，它能夠產(chǎn)生大量的甘油、酯類等代謝產(chǎn)物，并且能夠分泌蛋白酶、糖苷酶、果膠酶、脂肪酶等多種酶類，通過這些酶類的代謝作用可以將櫻桃果實(shí)中的香氣前體物質(zhì)分解并釋放出香氣組分，從而賦予酒體濃郁的發(fā)酵香味，提升產(chǎn)品風(fēng)味及感官質(zhì)量[9-11]。將產(chǎn)香酵母與釀酒酵母混合構(gòu)成發(fā)酵菌群，是目前果酒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。越來越多的學(xué)者開始著眼于產(chǎn)香酵母菌種資源的開發(fā)，以期獲得優(yōu)良菌種提升果酒的品質(zhì)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)法爾皮有孢漢生酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵能夠增加乙酯類物質(zhì)的生成，同時(shí)還可以降低乙醇含量[11,14]。美極梅氏酵母協(xié)同釀酒酵母共同發(fā)酵時(shí)，葡萄酒中的萜烯和內(nèi)酯等芳香族化合物含量會明顯增加[15]。假絲酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí)可以更好地控制葡萄酒的發(fā)酵進(jìn)程，促進(jìn)甘油、羥基丙酮、琥珀酸的合成，使果酒的特色更加突出[16]。戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母同時(shí)或依次進(jìn)行發(fā)酵，可以提高葡萄酒中乙醇和具果香酯類物質(zhì)的含量，同時(shí)能夠降低乙酸的含量[17]。

櫻桃酒產(chǎn)業(yè)在我國起步相對較晚，生產(chǎn)工藝尚不成熟，產(chǎn)品也存在一定的質(zhì)量缺陷，如特征香氣不明顯、果香不夠濃郁等[18]。使用產(chǎn)香酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵能夠有效解決以上問題，但是使用何種發(fā)酵菌株以及具體的發(fā)酵工藝仍亟待開發(fā)。本課題在前期研究中通過自主篩選獲得了1株產(chǎn)酯能力優(yōu)異且能夠較好耐受櫻桃酒發(fā)酵條件的產(chǎn)香酵母，經(jīng)鑒定該菌株是1株戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），編號為WA19。本研究以該菌株為研究對象，研究其在櫻桃酒釀造過程中的變化趨勢、與釀酒酵母的相互作用，以及對酒體組成、揮發(fā)性組分和感官品質(zhì)的影響，分別以釀酒酵母F33單獨(dú)發(fā)酵的櫻桃酒、商業(yè)化戴爾有孢圓酵母Viniflora Prelude和F33混合發(fā)酵的櫻桃酒為對照，深入挖掘戴爾有孢圓酵母WA19的潛力，以期為后續(xù)在櫻桃酒中規(guī)?；瘧?yīng)用該菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃品種為紅燈，采自煙臺，于2017年6月成熟并收集?；净瘜W(xué)成分：總糖155 g/L，總酸5.8 g/L（以蘋果酸計(jì)），pH 3.82。

釀酒酵母F33（簡稱F33） 法國Laffort公司；戴爾有孢圓酵母Viniflora Prelude 丹麥Hansen公司；戴爾有孢圓酵母WA19（簡稱WA19）保藏于魯東大學(xué)食品工程學(xué)院微生物菌種保藏中心；2-辛醇、香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；葡萄糖、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖50 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀550 mg，氯化鈣125 mg，氯化鐵2.5 mg，氯化鉀425 mg，硫酸錳2.5 mg，硫酸鎂125 mg，溴甲酚綠22 mg，瓊脂20 g，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min[19]。

賴氨酸瓊脂培養(yǎng)基（1 L）：D-葡萄糖10 g，DL-蛋氨酸2 mg，DL-色氨酸2 mg，L-組氨酸1 mg，對氨基苯甲酸200 μg，泛酸2 mg，生物素20 μg，葉酸2 μg，煙酸400 μg，鹽酸吡哆醇400 μg，核黃素200 μg，鹽酸硫胺素400 μg，肌醇10 mg，硼酸500 μg，碘化鉀100 μg，氯化銅40 μg，氯化鐵200 μg，鉬酸鈉200 μg，硫酸鋅400 μg，硫酸錳400 μg，磷酸氫二鉀150 mg，磷酸二氫鉀850 mg，氯化鈣100 mg，硫酸鎂500 mg，賴氨酸鹽酸鹽2.5 g，氯化鈉100 mg，瓊脂20 g，pH值自然，121 ℃滅菌20 min[19]。

YPD培養(yǎng)基（1 L）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-MS 5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；FE20K pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃酒釀造工藝

櫻桃采摘后清洗、破碎，于20 L發(fā)酵瓶中，裝液量為80%，加入50 mg/L SO2抑制果漿氧化。添加適量蔗糖使還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到210 g/L，然后接種酵母啟動發(fā)酵。本研究設(shè)計(jì)3 組實(shí)驗(yàn)，分別為戴爾有孢圓酵母WA19與釀酒酵母F33混合發(fā)酵（WA19/F33組合），戴爾有孢圓酵母Viniflora Prelude與釀酒酵母F33混合發(fā)酵（Viniflora Prelude/F33組合），以及F33單獨(dú)發(fā)酵（空白對照），具體過程如下：

混合發(fā)酵：先接種戴爾有孢圓酵母（WA19或Viniflora Prelude），接種量為106CFU/mL。戴爾有孢圓酵母WA19或Viniflora Prelude接種前需要進(jìn)行活化，即在YPD培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24～50 h。戴爾有孢圓酵母發(fā)酵48 h后接種釀酒酵母F33，接種量為300 mg/L，啟動乙醇發(fā)酵。

單獨(dú)發(fā)酵：僅接種戴爾有孢圓酵母F33啟動乙醇發(fā)酵，不接種產(chǎn)香酵母。

所有發(fā)酵均于28 ℃進(jìn)行，單獨(dú)發(fā)酵需要6～7 d，混合發(fā)酵需要8～10 d。整個發(fā)酵過程中，監(jiān)測果漿中糖度和酵母數(shù)的變化，定期攪拌循環(huán)。當(dāng)櫻桃酒還原糖質(zhì)量濃度低于4 g/L時(shí)，離心分離出酵母菌，終止乙醇發(fā)酵，并采用膨潤土-明膠法進(jìn)行下膠澄清處理，再經(jīng)硅藻土過濾澄清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

還原糖、總酸、乙醇體積分?jǐn)?shù)、揮發(fā)酸的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。具體如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)采用密度瓶法；還原糖采用斐林試劑法測定（以葡萄糖計(jì)）；揮發(fā)酸和總酸通過氫氧化鈉滴定法測定，分別以乙酸和蘋果酸計(jì)。甘油參照劉銳萍等[20]采用高效液相色譜法測定。

1.3.3 微生物生長的測定

采用梯度稀釋法測定釀酒酵母和戴爾有孢圓酵母在發(fā)酵過程中的生長情況。取5 mL櫻桃酒樣，用無菌生理鹽水梯度稀釋后（稀釋倍數(shù)為102～108），涂布于WL營養(yǎng)培養(yǎng)基，在28 ℃好氧條件下培養(yǎng)48 h后計(jì)算釀酒酵母的數(shù)目。酒樣經(jīng)稀釋后涂布于賴氨酸瓊脂培養(yǎng)基，在28 ℃好氧條件下培養(yǎng)72 h后計(jì)算戴爾有孢圓酵母的數(shù)量。

1.3.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的萃取

利用頂空固相微萃取法獲得櫻桃酒中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。將5 mL櫻桃酒、1.5 g NaCl和5 μL 2-辛醇（內(nèi)標(biāo)）依次加入15 mL頂空瓶中，加蓋密封，然后置于30 ℃水浴中預(yù)平衡10 min，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附揮發(fā)性組分，萃取時(shí)間為30 min[21]。

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對揮發(fā)性香氣組分進(jìn)行分離和檢測。色譜柱DB-Wax（60 m×0.25 mm，0.25 μm），不分流進(jìn)樣。采用程序升溫，初始溫度為40 ℃保持2 min，6 ℃/min升溫至230 ℃，持續(xù)15 min。載氣為氦氣，體積流量為2 mL/min。質(zhì)譜儀在70 eV的電子沖擊模式下進(jìn)行，掃描范圍為m/z 34～348，離子源溫度為230 ℃。

揮發(fā)性化合物定性分析通過比較來自NIST數(shù)據(jù)庫（安捷倫）的質(zhì)譜光譜數(shù)據(jù)和已經(jīng)被文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)（retention index，RI）確定。定量分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成一系列不同濃度的溶液，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]。

1.3.5 櫻桃酒感官評定

采用定量描述分析法對櫻桃酒的香氣特征進(jìn)行評價(jià)。評價(jià)小組由11 人組成，包括4 男7 女，年齡21～38 歲。小組成員預(yù)先接受為期4 周的培訓(xùn)，第1輪熟悉櫻桃酒及評價(jià)過程，初步產(chǎn)生描述語；第2輪以標(biāo)準(zhǔn)物或?qū)?yīng)實(shí)物對描述語的修正、補(bǔ)充與完善，形成櫻桃酒香氣特征的描述語詞匯表，包括果香、花香、醇香、發(fā)酵香、生青氣味和整體香氣；第3輪進(jìn)行標(biāo)度培訓(xùn)及其熟練使用訓(xùn)練；第4輪進(jìn)行綜合描述指導(dǎo)與訓(xùn)練[18]。

實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)品評室完成（單間小格90 cm×100 cm，低于40 dB噪音，通風(fēng)良好，周圍無雜物及產(chǎn)異味物等）。將20 mL左右的櫻桃酒樣品呈遞給評價(jià)員，每個樣品均以3位數(shù)字隨機(jī)編號并隨機(jī)擺放。要求品評者對樣品的香氣特征進(jìn)行選擇并打分，打分選取10 點(diǎn)制，即0～9（0為沒氣味，9為氣味最強(qiáng)），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[18]。評分在0～3為低強(qiáng)度，3～6為中等強(qiáng)度，6～9為高強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS v13.0（SPSS公司，美國）對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。利用方差分析和鄧肯氏多重比較確定酒樣指標(biāo)間的差異。所有的變量都經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化（1/Sdev）處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃酒發(fā)酵對酵母菌生長的影響

在櫻桃酒混合發(fā)酵過程中，先接種戴爾有孢圓酵母，因?yàn)槠洳荒鸵掖迹饕诎l(fā)酵初期進(jìn)行繁殖，之后再接種釀酒酵母，啟動乙醇發(fā)酵直至結(jié)束。2 種酵母菌在櫻桃酒中的生長狀況如圖1～3所示。

圖1 WA19/F33混合發(fā)酵和還原糖代謝過程Fig. 1 Growth kinetics and sugar consumption during cherry wine-making process with mixed WA19 and F33 culture

圖2 Viniflora Prelude/F33混合發(fā)酵和還原糖代謝過程Fig. 2 Growth kinetics and sugar consumption during cherry wine-making process with mixed Viniflora Prelude and F33 culture

圖3 F33單獨(dú)發(fā)酵和還原糖代謝過程Fig. 3 Growth kinetics and sugar consumption during cherry wine-making process with pure F33

如圖1所示，在櫻桃酒發(fā)酵初期，WA19能迅速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，迅速繁殖，數(shù)量急劇增加。發(fā)酵2 d后接種F33，F(xiàn)33也實(shí)現(xiàn)了快速生長，并保持較高的發(fā)酵速率，直至第5天，活細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高值（8.7×107CFU/mL）。WA19的活細(xì)胞數(shù)幾乎也在發(fā)酵第4、5天達(dá)到峰值，為1.3×108CFU/mL。之后，F(xiàn)33和WA19開始衰老死亡，數(shù)量逐漸減少。由圖2可知，在Viniflora Prelude/F33混合發(fā)酵對照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵初期Viniflora Prelude也能迅速適應(yīng)櫻桃汁環(huán)境，實(shí)現(xiàn)快速增殖，但是接種F33后，其生長受到一定程度的抑制，活細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)下降。F33的增殖也受到了影響，第7天活細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高值（3.2×107CFU/mL），發(fā)酵周期較WA19/F33混合發(fā)酵延長了2 d。在另一組對照實(shí)驗(yàn)中（F33單獨(dú)發(fā)酵），F(xiàn)33表現(xiàn)出最強(qiáng)的發(fā)酵動力，發(fā)酵第3天活細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高值（7.9×107CFU/mL），整個發(fā)酵周期只有7 d（圖3）。

在監(jiān)測發(fā)酵過程中還原糖變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)33利用糖的能力最強(qiáng)，還原糖濃度自接種F33后就開始急劇下降，發(fā)酵5 d時(shí)還原糖質(zhì)量濃度已低于15 g/L（圖3）。在混合發(fā)酵酒樣中（圖1、2），還原糖質(zhì)量濃度的變化趨勢類似，雖然發(fā)酵初期糖質(zhì)量濃度在迅速減少，但是發(fā)酵4 d后糖的消耗率開始下降，因此發(fā)酵周期也有所延長。

2.2 混合發(fā)酵對櫻桃酒基本理化指標(biāo)的影響

發(fā)酵結(jié)束后，離心去除酵母和發(fā)酵皮渣后測定櫻桃酒的基本理化指標(biāo)，結(jié)果如表1所示。

表1 櫻桃酒的基本理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical properties of cherry wines

WA19/F33混合發(fā)酵、Viniflora Prelude/F33混合發(fā)酵、F33單獨(dú)發(fā)酵的櫻桃酒還原糖質(zhì)量濃度都低于4 g/L，說明櫻桃酒已發(fā)酵完全。F33單獨(dú)發(fā)酵櫻桃酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)和甘油含量最高，說明F33純種發(fā)酵具有最強(qiáng)的還原糖轉(zhuǎn)化能力和甘油合成能力。pH值在4.06～4.09之間，總酸質(zhì)量濃度為5.46～5.60 g/L，在各個櫻桃酒之間存在一定差異。揮發(fā)酸含量的差異最為顯著，F(xiàn)33單獨(dú)發(fā)酵櫻桃酒的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度達(dá)到了0.48 g/L，而WA19/F33、Viniflora Prelude/F33混合發(fā)酵櫻桃酒的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度僅為0.31 g/L和0.37 g/L。

2.3 混合發(fā)酵對櫻桃酒揮發(fā)性組分的影響

表2 櫻桃酒主要芳香組分的含量Table 2 Concentrations of main volatile compounds in cherry wines mg/L

由表2可知，F(xiàn)33單獨(dú)發(fā)酵櫻桃酒的揮發(fā)性香氣總量為59.46 mg/L，而混菌發(fā)酵櫻桃酒的揮發(fā)性組分含量明顯增加，WA19/F33混合發(fā)酵為64.93 mg/L，Viniflora Prelude/F33樣品為63.67 mg/L。

2.3.1 酯類

酯類是構(gòu)成櫻桃酒香氣最重要的揮發(fā)性組分，在發(fā)酵過程中由酸類和醇類酯化形成。由表2可知，櫻桃酒中檢測到10 種酯類，混合發(fā)酵櫻桃酒的總酯含量較高，WA19/F33組合為6.97 mg/L，Viniflora Prelude/F33為6.77 mg/L，含量最低的是F33單獨(dú)發(fā)酵的櫻桃酒，為5.58 mg/L。對于這10 種酯類化合物，混合發(fā)酵提升了其中6 種酯類的含量，包括丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸苯乙酯，特別是前5 種化合物，其在混合發(fā)酵櫻桃酒中的含量幾乎是F33單獨(dú)發(fā)酵的2～3 倍，因此混合發(fā)酵可以顯著提升櫻桃酒的果香，改善櫻桃酒酯香不足的問題。就2 種戴爾有孢圓酵母而言，WA19更多地增加了丁酸乙酯、異戊酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量，而Viniflora Prelude則更多地提升了己酸乙酯和3-己烯酸乙酯的含量。

2.3.2 醇類

果酒中的揮發(fā)性醇類化合物主要來源于發(fā)酵、氨基酸的轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物的氧化。由表2可知，在櫻桃酒中共檢測到7 種醇類，混合發(fā)酵櫻桃酒的總醇質(zhì)量濃度較高，WA19/F33混合發(fā)酵為38.85 mg/L，Viniflora Prelude/F33為37.51 mg/L，含量最低的是F33單獨(dú)發(fā)酵的櫻桃酒，為32.26 mg/L。2 種戴爾有孢圓酵母均明顯增加了β-苯乙醇的合成量，其在WA19/F33和Viniflora Prelude/F33組合中含量分別是F33單獨(dú)發(fā)酵的1.8 倍和1.6 倍。就2 種戴爾有孢圓酵母而言，WA19更多地增加了丙醇、丁醇、苯甲醇的含量，而Viniflora Prelude則更多地提升了異丁醇和異戊醇含量。

2.3.3 酸類

酸類是構(gòu)成櫻桃酒香氣特征非常重要的貢獻(xiàn)者，但是當(dāng)其濃度過高時(shí)可能會導(dǎo)致櫻桃酒出現(xiàn)奶酪味或脂肪味等不良?xì)馕?，因此其含量需要控制在合適的濃度范圍內(nèi)。由表2可知，所有的櫻桃酒中均檢測到5 種酸類化合物，其中F33單獨(dú)發(fā)酵酒樣的總酸質(zhì)量濃度最高（18.8 mg/L），其次是Viniflora Prelude/F33混合發(fā)酵（16.51 mg/L），最少的是WA19/F33組合（16.08 mg/L）?；旌习l(fā)酵并未增加櫻桃酒中酸類物質(zhì)的總量，反而使其濃度降低，尤其是乙酸、2-甲基丁酸和己酸，它們在混合發(fā)酵櫻桃酒中的含量較F33單獨(dú)發(fā)酵分別降低了14.7%～20%、32.8%～48.2%和16.3%～28.1%。僅有2 種酸類，即2-甲基丙酸和辛酸，在混合發(fā)酵櫻桃酒中的含量超過了F33單獨(dú)發(fā)酵。

2.3.4 其他芳香類

除了揮發(fā)性酯類、醇類和酸類化合物外，櫻桃酒中還檢測到了醛類、萜烯類和異戊二烯類芳香組分，包括乙醛、苯甲醛、里那醇和β-大馬酮。由表2可知，混合發(fā)酵對醛類沒有顯著性影響，因?yàn)橐胰┖捅郊兹┑暮枯^F33單獨(dú)發(fā)酵沒有明顯變化。但是混合發(fā)酵提升了里那醇和β-大馬酮的含量，特別是WA19/F33組合，2 種化合物在WA19/F33混合發(fā)酵櫻桃酒中含量是F33單獨(dú)發(fā)酵的2.08 倍和1.43 倍。

2.4 氣味活度值計(jì)算

氣味活度值的計(jì)算廣泛應(yīng)用于食品關(guān)鍵氣味活性化合物的篩選和鑒定上，其計(jì)算方法為化合物濃度與該物質(zhì)嗅覺閾值的比值[22-23]。一般認(rèn)為，氣味活度值大于1，表明其對氣味有貢獻(xiàn)，氣味活度值越大表明該化合物個體貢獻(xiàn)越大。

表3 櫻桃酒中氣味活度值大于1的芳香化合物及其氣味特征Table 3 Mean values of OAV for volatile compounds with OAV > 1 in cherry wines

由表3可知，混合發(fā)酵櫻桃酒中的大多數(shù)香氣組分的氣味活度值都高于F33純種發(fā)酵，特別是丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯，以上這些揮發(fā)性酯類化合物具有典型的水果香氣，如香蕉、蘋果、菠蘿、梨等[23,25]，因而能夠賦予櫻桃酒更濃郁的果香。里那醇能夠散發(fā)出類似薰衣草氣味的花香[26]，其在混合發(fā)酵櫻桃酒中的氣味活度值顯著高于單純發(fā)酵，因而可能賦予混合發(fā)酵櫻桃酒更強(qiáng)烈的花香。由氣味活度值結(jié)果可推測混合發(fā)酵櫻桃應(yīng)該具有更濃郁的果香和花香，風(fēng)味特征會顯著優(yōu)于F33純種發(fā)酵，但實(shí)際結(jié)果還需要感官評價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 櫻桃酒的感官評定結(jié)果

由圖4可知，單獨(dú)接種F33的櫻桃酒具有中等強(qiáng)度的果香、醇香和發(fā)酵香，低強(qiáng)度的花香和生青氣味，整體評價(jià)為中等。接種WA19櫻桃酒的果香和花香最濃郁，同時(shí)具有中等強(qiáng)度的發(fā)酵香和醇香，以及低強(qiáng)度的生青氣味，香氣特征富有層次感，因此總體得分最高。Viniflora Prelude/F33組合也具有較高強(qiáng)度的果香，但花香、發(fā)酵香和醇香的評分不及WA19/F33組合，總體評分也低于WA19/F33。

圖4 櫻桃酒香氣品評結(jié)果Fig. 4 Sensory evaluation of cherry wines

3 討 論

3.1 混合發(fā)酵對戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母的影響

在戴爾有孢圓酵母WA19與釀酒酵母F33混合接種模式下，WA19在發(fā)酵前5 d一直在持續(xù)增殖，并達(dá)到了較高的菌體量。F33的最大活細(xì)胞數(shù)較其單獨(dú)發(fā)酵并未減少，說明WA19與F33之間不存在明顯的競爭性抑制，兩者共同主導(dǎo)發(fā)酵進(jìn)程。而在Viniflora Prelude與F33的混合發(fā)酵中，Viniflora Prelude與F33之間存在相互抑制，F(xiàn)33的最大活細(xì)胞數(shù)較其單獨(dú)發(fā)酵減少了12.7%，而Viniflora Prelude則在接種F33后開始衰亡。據(jù)文獻(xiàn)[29]報(bào)道，戴爾有孢圓酵母屬于溫和發(fā)酵型酵母，增殖速率較慢，與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵時(shí)容易被釀酒酵母抑制，但是一些特殊的戴爾有孢圓酵母卻具有較強(qiáng)的弒殺釀酒酵母特性，因其分泌了某些針對釀酒酵母的毒素或其他代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致釀酒酵母生長受到抑制。與Viniflora Prelude相比，自篩酵母WA19發(fā)酵更溫和，對釀酒酵母未產(chǎn)生明顯抑制，因此更適宜作為櫻桃酒發(fā)酵的產(chǎn)香酵母。

3.2 混合發(fā)酵對櫻桃酒基本理化指標(biāo)的影響

與F33單獨(dú)發(fā)酵相比，混合發(fā)酵在乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖、總酸含量三方面與之差異較小，但混合發(fā)酵顯著降低了揮發(fā)酸的質(zhì)量濃度，WA19/F33組、Viniflora Prelude/F33組合的揮發(fā)酸含量僅有F33單獨(dú)發(fā)酵的64.6%和77.1%。以往的研究認(rèn)為，非釀酒酵母發(fā)酵效率低、發(fā)酵不徹底，且會產(chǎn)生較高含量的揮發(fā)酸、乙醛等不良風(fēng)味物質(zhì)，會導(dǎo)致果酒的酸敗，對果酒釀造不利。后來有研究證實(shí)，戴爾有孢圓酵母在發(fā)酵過程中不會產(chǎn)生大量乙酸，且與釀酒酵母混菌發(fā)酵可以增加果酒的香氣復(fù)雜性，有利于果酒品質(zhì)的提高[11,29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)此結(jié)論，確認(rèn)了2 株戴爾有孢圓酵母在降低揮發(fā)酸含量方面的優(yōu)勢。

3.3 混合發(fā)酵對櫻桃酒香氣組分的影響

不同酵母的生理活性及代謝過程不同，對風(fēng)味物質(zhì)的影響也不同[30]。本研究中使用的戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵技術(shù)能夠提升櫻桃酒揮發(fā)性香氣組分的含量，增強(qiáng)櫻桃酒的香氣特征。WA19/F33組合、Viniflora Prelude/F33組合的香氣總量均約為F33單獨(dú)發(fā)酵的1.1 倍。

利用戴爾有孢圓酵母提高果酒香氣組分的含量是目前果酒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在葡萄酒釀造中的研究較多[29,31-32]，但是涉及櫻桃酒的報(bào)道很少。Lu Yi等[33]證實(shí)戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合使用能夠提高榴蓮酒中多種揮發(fā)性酯類化合物的產(chǎn)量。Viana等[34]發(fā)現(xiàn)，戴爾有孢圓酵母具有較強(qiáng)的產(chǎn)生辛酸乙酯的能力。Comitini等[35]發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母可以增大葡萄酒中β-苯乙醇的合成量。這些結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相符。苯乙醇質(zhì)量濃度的增加可能與戴爾有孢圓酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有關(guān)，也有可能是酵母中β-葡萄糖苷酶的活性與L-苯丙氨酸的代謝共同作用的結(jié)果[29]。

Azzolini等[36]研究發(fā)現(xiàn)，戴爾有孢圓酵母有利于酸類的積累，但在本研究中，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵卻使酸類含量降低，特別是乙酸、2-甲基丁酸和己酸。乙酸含量的降低會導(dǎo)致櫻桃酒揮發(fā)酸濃度下降，這與本實(shí)驗(yàn)中理化指標(biāo)的測定結(jié)果一致，且對提高櫻桃酒的品質(zhì)有積極作用?；旌习l(fā)酵中酸類的下降可能是其參與合成了芳香酯類，但具體原因還需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵有利于增加里那醇和β-大馬酮的含量，特別是在WA19參與的發(fā)酵中，這對于突出櫻桃酒的品種香氣有積極作用。Sun Shuyang等[37]發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母可以提升里那醇的含量。原因在于，與釀酒酵母相比，戴爾有孢圓酵母含有更多的糖苷水解酶，更有利于水解果酒中的結(jié)合態(tài)糖苷香氣物質(zhì)并促進(jìn)游離態(tài)香氣成分的釋放[38]。

在本研究中，雖然自篩的戴爾有孢圓酵母WA19和商業(yè)化戴爾有孢圓酵母Viniflora Prelude均能提高櫻桃酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)的合成量，但兩者之間也有顯著性差異。Viniflora Prelude更多地提高了己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、異丁醇、異戊醇和辛酸的產(chǎn)量，而WA19更多地促進(jìn)了丁酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、丙醇、丁醇、苯甲醇、β-苯乙醇、2-甲基丙酸、里那醇和β-大馬酮的合成，而且WA19參與發(fā)酵的櫻桃酒的香氣物質(zhì)總量更高。

3.4 櫻桃酒感官評定與香氣組分之間的關(guān)系

WA19/F33組合總體評分最高，Viniflora Prelude/F33組合次之，最低的是F33單獨(dú)發(fā)酵。品評結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中揮發(fā)性香氣組分測定結(jié)果基本符合，WA19/F33組合生成了豐富的酯類化合物，如丁酸乙酯、異戊酸乙酯、辛酸乙酯等，以上這些揮發(fā)性酯類化合物具有典型的水果香氣，因而能夠賦予WA19/F33櫻桃酒更濃郁的果香。里那醇能夠散發(fā)出類似薰衣草氣味的花香，它在WA19/F33組合中的含量最高，因而可能賦予該櫻桃酒最強(qiáng)烈的花香。在本研究中，接種戴爾有孢圓酵母的櫻桃酒的生青氣味較F33單獨(dú)發(fā)酵均有所下降，推測可能是由于較高強(qiáng)度的果香和花香在一定程度上掩蓋了生青氣味。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究戴爾有孢圓酵母WA19和釀酒酵母F33混合發(fā)酵對櫻桃酒質(zhì)量的影響，以F33單獨(dú)發(fā)酵櫻桃酒和Viniflora Prelude/F33混合發(fā)酵櫻桃酒為對照。研究結(jié)果表明，WA19能夠快速適應(yīng)酒體環(huán)境，迅速增殖，且不會對釀酒酵母的生長產(chǎn)生影響。WA19/F33混合發(fā)酵對酒體的理化指標(biāo)幾乎不產(chǎn)生影響，但是可以顯著提高多種芳香化合物含量，增強(qiáng)其風(fēng)味特征。櫻桃酒感官評定的結(jié)果表明，WA19/F33混合發(fā)酵增強(qiáng)了櫻桃酒的果香、花香和發(fā)酵香氣，并在一定程度上掩蓋了生青氣味，使櫻桃酒的香氣特征更鮮明，解決了櫻桃酒果香寡淡的問題。