張建貴，韓華雯，姚 拓，李海云，胡彥婷，馬亞春，楊琰珊，董 凱，崔文平，(.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070； .甘肅農(nóng)業(yè)大學 林學院，甘肅 蘭州 730070)

微生物接種劑在農(nóng)業(yè)領域應用技術已逐步成熟，廣泛應用于多種牧草、糧食作物、蔬菜和中草藥等領域。研究表明，大豆植株接種根瘤菌和假單胞菌，大豆磷含量、鐵離子含量分別提高了88.9%、115.7%，且其全碳、全氮和豆血紅蛋白的含量以及根瘤數(shù)目均有增加[1]。Abbasi等[2]從小麥根際分離出具有分泌IAA功能的細菌并接種于小麥根際，發(fā)現(xiàn)該菌對小麥促生效果明顯，給辣椒接種芽孢桿菌(Bacillus)后辣椒產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物(包括吲哚乙酸、鐵載體和幾丁質酶)含量均可增加[3]。

岷山紅三葉施用復合菌肥能提高生產(chǎn)性能和營養(yǎng)品質，苜蓿施用PGPR菌肥其產(chǎn)量可提高30.1%、粗蛋白提高20.1%，而粗纖維含量顯著降低[4-5]，玉米接種微生物接種劑后其株高、生物量、土壤養(yǎng)分含量均增加，同時土壤病原菌數(shù)量在減少，箭筈豌豆接種微生物接種劑后與不接種相比其根系活力增加38.3%，且幼苗高度、生物量均有增加[6-7]。微生物接種劑既能提高植物產(chǎn)量和品質，又能改善土壤結構增加土壤微生物數(shù)量。新墾地接種微生物接種劑后，土壤全氮、全磷分別提高58.8%和8.0%[8]。高溫悶棚施用生物菌肥可使植物根際的細菌數(shù)量增加68.2%～84.1%，其種植的黃瓜、甜椒產(chǎn)量分別提高了7.68%、5.54%[9]。

為實現(xiàn)我國化肥使用零增長的目標，恢復土壤原生態(tài)結構，尤其是在長期施用化肥地中使用接種劑可使土壤結構向恢復的方向發(fā)展。而接種劑作用效果除了與菌株的來源、特性、有效活菌數(shù)和載體性質有關，還與土壤養(yǎng)分、水分、溫度、濕度和pH等有關，此外接種劑施用方式、施用量和使用季節(jié)也決定接種劑的使用效果。

試驗利用甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院微生物課題組PGPR資源庫的優(yōu)良菌株，選用農(nóng)業(yè)廢棄物(花土、馬鈴薯渣、木炭、泥炭和菌糠)作為微生物接種劑載體，探究不同材料載體研制的的微生物接種劑對蘇丹草生長和品質以及土壤養(yǎng)分、土壤3大微生物數(shù)量的變化，以期篩選出蘇丹草最適微生物接種劑的載體，為禾本科牧草增產(chǎn)、增效提供科學的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗區(qū)地位于定西市安定區(qū)香泉鎮(zhèn)，地理位置N 35°33′，E 104°35′，海拔1 896.7 m，光照充足，干旱少雨，蒸發(fā)強烈，屬典型的半干旱區(qū)。年日照為2 433 h，年均降水量383.8 mm，年均氣溫6.7℃，7月最高平均氣溫25.9℃，1月最低平均氣溫-13.0℃。夏、冬兩季月平均降水量分別為150～270 mm、20～80 mm。7～10月的降水量占年降水量的86.9%，潛在蒸發(fā)量年平均高達1 500 mm。土壤類型以黃綿土為主，肥力均勻地勢平坦，土壤全氮、堿解氮、有機質、有效磷、全鉀和速效鉀含量分別為0.78 g/kg、48.00 mg/kg、10.37 g/kg、13.35 mg/kg、22.40 g/kg、204.00 mg/kg，pH 7.68。

1.2 供試品種及菌株

供試品種為大力士蘇丹草(Sorghumsudanense)作為旱區(qū)高產(chǎn)穩(wěn)收的一年生禾本科優(yōu)質牧草，其適應性強，飼用價值高，適用于調制干草、青飼和青貯等。

供試菌株由課題組PGPR資源庫提供(表1)，菌株具備固氮、溶磷、分泌IAA特性及生長快、競爭強、菌落形態(tài)明顯等特點。

表1 菌株特性Table 1 Strains characteristics

1.3 微生物接種劑制備、施用及設計

Jm170，G、Lx191和Jm92菌株分別接種于LB液體搖瓶中，接菌的搖瓶置于轉速200 r/min，溫度30℃搖床中培養(yǎng)48 h，待各搖瓶的細菌數(shù)量至108cfu/mL即可使用?；旌瞎δ芫簽榻硬煌甑木阂砸欢ū壤?1∶1∶1∶1)混合均勻。用不同配比載體接混合功能菌制作微生物接種劑，將制作好的微生物接種劑置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待用。

選粒大飽滿的蘇丹草種子(無農(nóng)藥包衣)與接種劑混合均勻，且種子與接種劑質量比4∶11[7]，對照處理種子用無菌水拌種。種子與接種劑混合均勻后置于陰暗處處理2 h。過磷酸鈣(P2O5≥14%)以75 kg/hm2的施肥量作基肥，蘇丹草各生育時期均不追肥，但根據(jù)當?shù)赜晁闆r，可進行田間常規(guī)灌溉。

試驗采用田間溝壟覆膜(寬1.2 m)種植。播種為穴播、播種量13.3 kg/hm2，蘇丹草行距和株距分別為40 cm和60 cm。試驗采用隨機區(qū)組設計，9個處理，6個重復，54個小區(qū)，每個小區(qū)面積30 m2(表2)。

表2 試驗處理Table 2 Experimental treatments

1.4 蘇丹草營養(yǎng)品質，土壤速效養(yǎng)分和土壤3大類微生物數(shù)量測定

蘇丹草株高和干鮮比分別于孕穗期測定，每個小區(qū)重復10次；每個小區(qū)隨機取2 m×2 m的樣方進行齊地刈割，風干至恒重用于測定干草產(chǎn)量。將干草粉碎過篩(孔徑0.5 mm)用于測定粗蛋白(凱氏定氮法)和全磷(氫醌-亞硫酸鈉法)。

孕穗期取蘇丹草根部土壤(0～30 cm)樣品用于土壤速效鉀、有效磷含量測定，每個小區(qū)隨機取10個樣點。速效鉀含量采用醋酸銨-原子吸收分光光度計法進行測定，有效磷含量采用高錳酸鉀氧化-葡萄糖還原法進行測定。

各地區(qū)要成立由草原行政部門主要領導、分管領導參加的草原鼠災防治指揮部，夯實工作責任，認真組織落實草原鼠害防治工作；要結合當?shù)貙嶋H制定項目實施方案，抓住關鍵時期和重點環(huán)節(jié)，細化防治目標和任務，提出資金使用意見，加強督促和指導，落實各項工作措施。

將蘇丹草根部土壤(0～20 cm)樣品用于土壤3大微生物數(shù)量測定，其中牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基用于測定細菌數(shù)量，改良高氏一號培養(yǎng)基用于測定放線菌數(shù)量，馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基用于測定真菌數(shù)量。

N=M×鮮土重/干土重

式中：M=a×u/v，N為每1 g干土的菌數(shù)；M為每1 g鮮土的菌數(shù)；v為每個培養(yǎng)皿中加懸浮液體積(50 μL)；a為培養(yǎng)皿中平均菌落數(shù)；u為稀釋倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析法，Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗，用Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2.1 不同載體研制的微生物接種劑對蘇丹草農(nóng)藝性狀的影響

2.1.1 對蘇丹草株高的影響 孕穗期蘇丹草的株高由高至低的處理依次為F2>F3>F1>F6>MR>CK>F4>F5>P，其中，F(xiàn)2和F3的株高較高，分別為320 cm和318 cm，而P處理蘇丹草株高最低，為291 cm。各處理蘇丹草的株高較P處理高6.38%～12.68%，各處理(除P，F(xiàn)4和F5)株高較CK提高了1.99%～5.39%，F(xiàn)2和F3的株高均顯著高于P(P<0.05)，其余各處理與CK相比差異不顯著(P>0.05)(圖1-A)。

2.1.2 對蘇丹草干鮮比的影響 不同接種劑處理對蘇丹草干鮮比變化明顯，孕穗期不同處理的蘇丹草干鮮比由高至低依次為0.34% (F1)> 0.24%(F4)> 0.23% (CK)> 0.22% (P、MR)> 0.21% (F3、F6)> 0.19% (F2)> 0.18% (F5)。F1的干鮮比與CK相比差異顯著且提高了47.82%(P<0.05)、與F5存在顯著差異且較F5提高了85.45%(P<0.05)，F(xiàn)4干鮮比雖高于CK但差異不顯著(P>0.05)，而其余處理均不及CK(圖1-B)。

2.1.3 對蘇丹草干草產(chǎn)量的影響 不同微生物接種劑處理下蘇丹草的干草產(chǎn)量(103kg/hm2)由高至低依次為39.25 (F1)>38.83(F4)>38.80 (P)>38.73 (MR)>38.65(F3)>38.63(F5)>38.60(F6)>38.50(F2)>38.43(CK)。各處理與CK相比，施用接種劑蘇丹草干草產(chǎn)量可提高0.17%～2.12%，F(xiàn)1、F4處理的蘇丹草干草產(chǎn)量分別是P處理的1.01倍、1.00倍?？梢姡煌⑸锝臃N劑均能顯著提高蘇丹草干草產(chǎn)量，其中，F(xiàn)1、F4對蘇丹草干草產(chǎn)量促進效果最好(圖1-C)。

圖1 不同微生物接種劑處理下蘇丹草的農(nóng)藝性狀Fig.1 The effects of different microorganism inoculants on agronomic traits

2.2 不同載體研制的微生物接種劑對蘇丹草營養(yǎng)品質的影響

2.2.1 對蘇丹草粗蛋白質含量的影響 蘇丹草粗蛋白含量從高至低的處理依次為F1>F4>F6>F3 >MR>P>F2>F5>CK。其中，F(xiàn)1處理粗蛋白含量最高，為9.55%，較CK提高了15.3%，F(xiàn)3為9.03%，CK粗蛋白含量最低，為8.21%。不同接種劑(除F2和F5)較P高1.6%～12.2%，除P和F2與CK表現(xiàn)差異不顯著，其余處理均與CK差異顯著(P<0.05)。接種劑F1，F(xiàn)6和F4對蘇丹草粗蛋白具有顯著提高效果(圖2-A)。

2.2.2 對蘇丹草全磷的影響 不同接種劑對蘇丹草全磷含量均有影響，全磷含量由高至低的處理依次為F5>F6>MR>F1>F4>F3>CK>P>F2。各接種劑處理(除P、F2外)較CK全磷含量可提高6.7%～26.7%，F(xiàn)2最低為0.26%，F(xiàn)5含量最高，為0.38%，F(xiàn)5與CK存在顯著差異(P<0.05)，其余處理均與CK差異不顯著(圖2-B)。

圖2 不同微生物接種劑處理下蘇丹草的營養(yǎng)品質Fig.2 The effects of different microorganism inoculant on nutritional quality

2.3 不同載體研制的微生物接種劑對蘇丹草土壤速效養(yǎng)分的影響

2.3.1 對蘇丹草土壤有效磷的影響 不同接種劑對蘇丹草土壤有效磷含量的變化均有影響。施用接種劑后土壤有效磷含量由高到低的處理依次為F4>F3>F5>F1>MR>P>F6>F2>CK，不同接種劑較CK可提高9.5%～45.2%，除F2和F6與CK差異不顯著，其余各處理與CK均表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。與處理P相比，其余各處理(除F2和F6)均可提高4.2%～20.9%。不同接種劑對土壤有效磷含量的提升效果較好的依次為F4(5.78 mg/kg)>F3(5.67 mg/kg)>F2(4.50 mg/kg)(圖3-A)。

圖3 不同微生物接種劑處理下蘇丹草的土壤速效養(yǎng)分含量Fig.3 The effects of different microorganism inoculant on soil available nutrient

2.3.2 對蘇丹草土壤速效鉀的影響 不同接種劑對蘇丹草土壤速效鉀含量影響不同，施用接種劑后土壤速效鉀含量由高到低的處理依次為F3>F5>P>F4>F1>MR>F2>F6>CK。其中，F(xiàn)3的土壤速效鉀含量顯著高于CK且其值為130.4 mg/kg(P<0.05)，與P相比土壤速效鉀含量可提高5.3%。各接種劑(除F6)速效鉀含量較CK均可提高2.2%～13.5%，除F3外，其余接種劑均與CK差異不顯著(P>0.05)。因此，接種劑F3、F5對土壤速效鉀提升效果較顯著(圖3-B)。

2.4 不同載體研制的微生物接種劑對蘇丹草土壤微生物的影響

不同接種劑處理的蘇丹草土壤微生物總數(shù)(×105cfu/g)依次為F3(25.49)>F6(12.02)>F4(8.87)>F1(8.20)>P(4.96)>MR(4.80)>F2(3.82)>CK(3.47)>F5(2.45)。其中，施用接種劑土壤放線菌數(shù)量是CK的2.3～6.9倍，F(xiàn)3最高(1.25×105cfu/g)，F(xiàn)6最低(0.41×105cfu/g)；施用接種劑土壤放線菌數(shù)量均顯著高于CK(P<0.05)，除F2、F5土壤細菌數(shù)量是CK的1.11～7.37倍，其中，F(xiàn)3數(shù)量最高(24.25×105cfu/g)，F(xiàn)5最低(1.85×105cfu/g)，土壤細菌數(shù)量MR，F(xiàn)2和F5均顯著高于CK(P<0.05)；施用接種劑土壤真菌數(shù)量是CK的6～30倍，其中F3真菌數(shù)量最高(1.50×103cfu/g)，F(xiàn)2、F5最低(0.30×103cfu/g)，土壤真菌數(shù)量均顯著高于CK(P<0.05)。施用接種劑可改變土壤微生物數(shù)量，其中F3處理土壤微生物數(shù)量最多(表3)。

表3 不同微生物接種劑處理下蘇丹草土壤的微生物數(shù)量Table 3 The effects of different microorganism inoculant on soil microorganism of Sudan grass (cfu/g)

3 討論

3.1 微生物接種劑使用與蘇丹草農(nóng)藝性狀、營養(yǎng)品質的關系

用不同載體研制的微生物接種劑對蘇丹草株高和干鮮比均有促生效果，但差異不明顯，而F1、F3處理蘇丹草株高可增高2.9%，F(xiàn)1、F4對蘇丹草干草產(chǎn)量增產(chǎn)效果較好，均在10%，這與姚拓等[10]、席琳喬等[11]研究發(fā)現(xiàn)從禾本科(草坪草，燕麥和小麥)植物根際分離的聯(lián)合固氮菌制成的微生物接種劑作用于該植物可顯著提高其株高和產(chǎn)量的研究結果相一致。微生物接種劑F1，F(xiàn)3和F4對蘇丹草促生效果較顯著，出現(xiàn)這一結果可能是這3種接種劑的載體更適于微生物生長繁殖，其繁殖過程中不僅能分泌GA，ABA和CTK等生長激素，還能為植物補充營養(yǎng)元素、調控植物生長，故而達到增產(chǎn)效果[12]，然而施用F2接種劑的效果不明顯，可能是因為農(nóng)業(yè)廢棄物載體馬鈴薯淀粉渣空隙大、保水性差，不易混合功能菌在該載體上存活，從而影響其應用效果，或該接種劑有益菌在植物根際定殖能力較低而無法發(fā)揮作用。植物根際的細菌既能促進植物吸收微量元素錳，又能調控土壤中錳的還原，錳作為酶的活化劑在植物光合作用、N代謝中發(fā)揮極其重要的作用[13]。周毅等[14]選用溶磷微生物有機肥對冬小麥產(chǎn)量進行試驗，結果表明解磷微生物有機肥對冬小麥增產(chǎn)達到8.7%。試驗表明，不同接種劑對蘇丹草的粗蛋白和全磷含量影響明顯，表現(xiàn)在復合載體接種劑>單一載體接種劑>CK，其原因可能為復合載體接種劑更適于PGPR生長繁殖進而間接提高蘇丹草營養(yǎng)品質；施用不同接種劑可提高蘇丹草粗蛋白含量1.0%～15.3%，其中F1、F3效果較好，這一結果與有關學者對聯(lián)合固氮菌來源于水稻根際并接種于水稻的研究發(fā)現(xiàn)可提高水稻植株粗蛋白含量(P<0.05)的結果一致[15]，Hodencia等[16]的關植物根際促生菌對番茄果實品質研究發(fā)現(xiàn)，接種植物根際促生菌可有助于提高番茄果實的質地和大小的結果相近。此外，馮瑞章等[17]研究表明，磷礦粉在溶磷菌和固氮菌協(xié)同作用下溶解效果顯著優(yōu)于溶磷菌單獨培養(yǎng)效果。出現(xiàn)這一結果與接種劑載體、菌株特性有關，或與混合功能菌分泌物會彌補單一接種的缺陷的機理有關，其分泌物會促進土壤微生物氮素生理群生長繁殖，加速土壤氮循環(huán)，故而促使植物對氮的吸收利用[18]，而接種劑對植株的全磷含量影響不顯著，可能因為土壤磷素含量已達到植物需求，接種劑里的溶磷菌在土壤中溶解的磷不能被植物反映。

3.2 接種劑施用與土壤速效養(yǎng)分的關系

施用接種劑可提高土壤養(yǎng)分從難溶性向可溶性轉化的速率，促使土壤肥力向養(yǎng)分富集化方向發(fā)展，韓光等[8]表明新墾地接種復合PGPR接種劑可顯著提高土壤速效養(yǎng)分，也有學者發(fā)現(xiàn)油菜與解磷菌肥拌種能夠提高土壤養(yǎng)分含量(如速效鉀、堿解氮、速效磷)，提高土壤脲酶和磷酸酶活性，特別是在低磷、中磷水平條件下溶磷菌群表現(xiàn)效果更為突出，溶磷菌肥應用具有重要的經(jīng)濟價值[19]。研究表明，不同接種劑對土壤速效養(yǎng)分有著不同程度的變化，與CK相比可提高土壤有效磷、速效鉀(除F6)9.5%～45.2%、2.2%～13.5%。這與逄煥成等[20]研究有關添加解鉀菌與芽孢桿菌的制成的微生物接種劑處理的土壤，其有效磷含量可提高71.4%、有機質提高55.9%、速效鉀提高28.9%和堿解氮提高50.2%的研究結果一致。聶文翰等[21]通過復合接菌劑秸稈堆肥對土壤碳、氮含量和酶活性的影響研究發(fā)現(xiàn)，施用復合接菌劑不僅提高土壤酶活性還能提高土壤氮素、磷素、鉀素的含量。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)復合載體接種劑的有效活菌數(shù)優(yōu)于單一載體接種劑，更優(yōu)于對照，進一步驗證了有效活菌數(shù)決定微生物接種劑作用于大田的效果。

3.3 接種劑施用與土壤微生物的關系

土壤微生物是衡量土壤活力的重要指標，有學者發(fā)現(xiàn)在晚稻上施用多功能微生物復合菌肥可大幅度提高土壤微生物優(yōu)勢菌群的數(shù)量[22]。試驗表明，施用接種劑對土壤微生物數(shù)量影響顯著，其中，細菌數(shù)量增長較顯著，放線菌和真菌也略有增長，但各試驗小區(qū)未發(fā)現(xiàn)植物病害發(fā)生，其中F3土壤微生物數(shù)量增長最明顯。這與張麗娜等[23]研究施用微生物菌肥后蘿卜各生育時期微生物數(shù)量均高于對照的結果相一致，與尹淑麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)施入復合微生態(tài)菌劑后可顯著提高土壤中細菌和放線菌的數(shù)量的結果相一致，出現(xiàn)這一結果可能因為菌肥的施入給植物帶入外源促生菌。孫廣正等[25]研究報道施用微生物接種劑能抑制西葫蘆根腐病的發(fā)生且抑制率達到66.80%，同時可替代15%的化肥投入也能達到促生的效果?？梢姡┯镁始饶芤种撇≡纳L，又能促進土壤微生物多樣性的提高。有報道，微生物接種劑對土壤本土微生物習性影響較小，外來接種的促生菌不會對土著微生物種群造成負面影響[26]。土壤是一個神秘“黑匣子”，維持土壤微生態(tài)平衡，研究表明接種微生物接種劑可引起土壤微生物構成發(fā)生極小部分的變化，但施用接種劑后土壤微生物群落結構變化尚未清楚，需進一步采用熒光標記、高通量等技術進行深入研究。

4 結論

用不同載體研制的微生物接種劑不僅對蘇丹草的生長和品質以及土壤養(yǎng)分有一定的影響，而且可調控土壤的微生物區(qū)系，抑制病原菌的生長。

(1)利用F1，F(xiàn)3和F4配方作為載體研制的的微生物接種劑對蘇丹草的農(nóng)藝性狀和品質均有促進作用。其中，F(xiàn)1、F3與CK相比其株高分別提高了2.91%、5.00%，F(xiàn)1、F4的粗蛋白含量與CK相比分別增加了15.32%、12.31%。

(2)對土壤養(yǎng)分和微生物數(shù)量變化有較明顯影響的處理有F3，F(xiàn)4和F5。其中，F(xiàn)3、F4載體微生物接種劑的土壤有效磷含量較CK提高了46.25%、44.58%，F(xiàn)3、F5土壤微生物數(shù)量較CK提高了12.09%、8.89%。

(3)綜合分析，利用F3(40%木炭+40%泥炭+20%花土)作為微生物播種的載體比其他載體配方對蘇丹草生長、土壤養(yǎng)分及微生物數(shù)量有較好的促生效果。因此，F(xiàn)3可作為蘇丹草微生物接種劑的專用載體。