燕麗 鄭蕊 沈征宇

皮膚是人體最大的器官，位于人體表面，具有吸收營養(yǎng)、排泄廢物、調(diào)節(jié)體溫和保護(hù)機(jī)體免受外界傷害的作用[1]。皮膚的完整性破壞時，易導(dǎo)致急慢性感染、電解質(zhì)紊亂和體液流失等問題[2]。當(dāng)皮膚創(chuàng)面超過4 cm直徑時，需借助皮膚移植才能較好愈合[3]。但無論是皮膚的自體移植、異體移植或異種移植，都存在著來源不足、疾病傳播和免疫排斥等問題，組織工程皮膚成為解決這些問題并極具應(yīng)用前景的可能的方法，近年來得到越來越多的關(guān)注[4-5]。

靜電紡絲技術(shù)是通過高壓靜電場，將符合目標(biāo)組織化學(xué)、生物、物理要求的組分進(jìn)行交聯(lián)，從而制作亞微米至納米級別的復(fù)合型組織工程支架的常用技術(shù)[6]。 明膠（Gelatin，GT）/聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）納米纖維電紡膜被證實在組織工程皮膚領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。其中，GT是一種細(xì)胞外基質(zhì)中提取的水溶性天然成分，為細(xì)胞黏附、增殖、分化提供適宜空間；PCL是一種脂溶性人工合成材料，其降解速率較緩，具有良好的機(jī)械特性[7]。將GT與PCL等質(zhì)量比例結(jié)合并進(jìn)行混合電紡，制作的支架材料具有孔隙率大、比表面積高、力學(xué)強(qiáng)度好等優(yōu)點，且生物相容性好。動物實驗證實，GT/PCL納米纖維電紡膜能顯著提高皮膚修復(fù)能力[8]。

皮膚創(chuàng)面愈合過程包含炎癥期、增殖期和皮膚結(jié)構(gòu)重塑期[2]，這些過程中不僅需要力學(xué)支撐，還需要眾多細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長因子的參與。表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和遷移，胰島素可減輕炎癥反應(yīng)，氫化可的松和維甲酸（Retinoic acid，RA）能促進(jìn)表皮生長和誘導(dǎo)干細(xì)胞分化[9]。研究證實，聯(lián)合這些活性物質(zhì)能促進(jìn)表皮生長和加速傷口愈合，并將其簡稱為表皮誘導(dǎo)因子復(fù)合體（Epidermal inducing factors，EIF）[10]。

本研究擬通過混合靜電紡絲技術(shù)制備含有EIF的可降解的GT/PCL納米纖維電紡膜，研究其生物學(xué)特性和體外促進(jìn)hADSCs向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的可行性，為制備可應(yīng)用于臨床的組織工程表皮提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備

GT（Gelatin Powder，G1890）、RA（Retinoic acid，R2625）、氫化可的松（Hydrocortisone，H0888）、胰島素（Recombinant insulin human，I2643）購自美國 Sigma公司；PCL（Polycaprolactone,440744-500G）購自美國Aldrich公司；人表皮生長因子重組蛋白（Human EGF Recombinant Protein，BMS320）購自美國eBioscience公司。

磁力攪拌器 （鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；精確微量注射泵（LSP01-1A，保定市蘭格恒流泵有限公司）；靜電紡絲儀器（KDS-100型，美國Le-Parmer公司）；靜電紡絲高壓電源 （天津市東文高壓電源廠）；真空冷凍干燥儀（上海實驗室儀器有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800型，日本JEOL公司）；全自動透射電子顯微鏡 （TEM，JEM-2010F型，日本JEOL公司）；生物力學(xué)測試儀（Instron-5542，美國Instron公司）；生物力學(xué)分析儀（Instron 5542-C4598，美國）；全波長酶標(biāo)儀（BioTek ELx800，美國BioTek公司）；倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯IX53，日本奧林巴斯株式會社）；單反相機(jī)（黑卡DSC-RX100 M3，日本索尼公司）。

1.2 納米纖維電紡膜的制備與分組

EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜（實驗組）：稱取等質(zhì)量的 GT 與 PCL 粉劑 （GT∶PCL 質(zhì)量比例＝1∶1）溶于六氟異丙醇（HFIP），調(diào)節(jié)質(zhì)量體積比為10%，配置GT/PCL溶液。微量天平稱取EIF各組分粉劑，加入GT/PCL溶液中攪拌均勻，使各組分終濃度為：1 μg/mL EGF、40 μg/mL 氫化可的松、0.5 mg/mL 胰島素、0.5 μmol/L RA，得到EIF-GT/PCL溶液。將EIF-GT/PCL溶液置于精確微量注射泵中，連接靜電紡絲儀器，接通靜電紡絲高壓電源。調(diào)整靜電紡參數(shù)：電壓為15 KV，推進(jìn)速度0.6 mL/h，接收距離為15 cm，室溫為25℃，環(huán)境濕度40%～50%；行混合靜電紡絲，以鋁箔接收（圖1）。

圖1 混合靜電紡絲法制備EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜模式圖Fig.1 The schematic view of EIF-GT/PCL electrospun nanofibrous membrane by blending electrospun technology

GT/PCL納米纖維電紡膜（對照組）：將單純GT/PCL溶液置于精確微量注射泵中，余同實驗組。

將上述兩組所得靜電紡絲分別置入含有25%戊二醛蒸汽的密閉容器皿中熏蒸30 min，以達(dá)到充分交聯(lián)，最終真空凍干24 h取出備用。

1.3 納米纖維電紡膜檢測指標(biāo)

1.3.1 大體和微觀形貌表征

將實驗組和對照組納米纖維電紡膜裁減為直徑15.6 mm的圓片，比較兩種材料的大體表面形態(tài)。兩組靜電紡絲過程中，直接將部分紡絲收集在300目銅網(wǎng)碳支持膜（蘇州晶硅科技有限公司）上，將這部分紡絲行透射電鏡觀察單根納米纖維特征，并以掃描電鏡觀察納米纖維排布情況。

1.3.2 力學(xué)特性比較

將實驗組和對照組兩種納米纖維電紡膜裁剪為30 mm×10 mm×（0.1～0.2） mm 的長方形，各取 5片，設(shè)定最大拉力10 N，拉伸速度10 mm/min，最終拉伸長度40 mm，進(jìn)行拉力測試。比較實驗組和對照組的彈性模量和樣品破裂前能承受的最大拉力載荷。

1.3.3 藥物釋放曲線

將兩組電紡膜分別裁減為每片質(zhì)量 （50±2）mg，分別浸泡于裝有10 mL PBS的離心管中，置于37℃恒溫?fù)u床中避光震蕩。每組設(shè)5個平行樣本。在第1、3、6、9、12 和 15 天，從每個離心管中分別取 1 mL上清液待測，并加入1 mL新鮮PBS。用EGF代表EIF的生物活性因子成分，采用人EGF免疫定量試劑盒，參照說明書進(jìn)行上清液中EGF含量測定，計算EGF的累積釋放率。

1.4 hADSCs的培養(yǎng)

hADSCs（第3代）取自上海市組織工程研究重點實驗室細(xì)胞樣本庫。將保存有hADSCs的凍存管從液氮罐取出并迅速復(fù)蘇，以1×104cells/mL的密度將hADSCs接種于24孔板，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 hADSCs增殖曲線測定

光學(xué)顯微鏡下觀察hADSCs形態(tài)，通過CCK-8法測定細(xì)胞增殖曲線。檢測當(dāng)天吸除24孔板中原有培養(yǎng)液，再加入500 μL新鮮培養(yǎng)液及50 μL CCK-8試劑，置于37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱2 h，然后每孔吸取100 μL培養(yǎng)液于96孔板中，450 nm處測定每孔吸光度值，繪制增殖曲線。

1.6 hADSCs-納米纖維電紡膜復(fù)合物的制備

實驗組和對照組各取6片直徑15.6 mm的圓形納米纖維電紡膜，平鋪入24孔板內(nèi)。紫外線消毒2 h。將hADSCs以1×106cells/mL的密度接種于納米纖維電紡膜上并覆蓋其表面，加入低糖DMEM培養(yǎng)液，將24孔板置入37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液。

1.7 hADSCs-納米纖維電紡膜復(fù)合物檢測指標(biāo)

1.7.1 hADSCs黏附情況和增殖情況

分別于第1天和第7天將hADSCs-納米纖維電紡膜復(fù)合物取出，以2.5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察hADSCs在兩組電紡膜上的黏附情況；CCK-8法測定第1、3、5、7天時hADSCs在納米纖維電紡膜上的增殖情況。

1.7.2 電紡膜誘導(dǎo)hADSCs向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

CK10是一種干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化早期標(biāo)志；CD105是間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志。將hADSCs分別接種于兩組電紡膜上培養(yǎng)7 d后，加入CK10和CD105單克隆抗體（一抗），4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次后，加入AlexaFluro 594和AlexaFluro 488（二抗），室溫下孵育 60 min，PBS清洗 3遍，加入DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組電紡膜形貌特征

兩組大體結(jié)構(gòu)相似，均呈光滑、白色膜片，無明顯凹凸不平。透射電鏡顯示，實驗組和對照組單根纖維結(jié)構(gòu)相似，粗細(xì)、密度均勻，未見明顯液相分離。掃描電鏡顯示，實驗組與對照組纖維均無黏連，無串珠；纖維間相互交錯，具有一定的孔隙率（圖2）。

圖2 實驗組和對照組大體和微觀形貌觀察Fig.2 The morphology of experimental group and control group

2.2 納米纖維電紡膜理化特性比較

2.2.1 力學(xué)特性比較

實驗組彈性模量（0.376±0.027） MPa，對照組彈性模量（0.381±0.021）MPa，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。實驗組拉力載荷最大值（1.164±0.333）N，對照組拉力載荷最大值（1.267±0.183）N，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）（圖 3A、B）。

2.2.2 藥物釋放率比較

實驗組EGF的釋放曲線顯示，EGF可平穩(wěn)釋放15 d以上，在第15天時釋放率達(dá)到36.5%，釋放曲線仍呈上升趨勢；對照組無EGF釋放（圖3C）。

圖3 實驗組和對照組的力學(xué)特征及藥物釋放率比較Fig.3 Mechanical properties and the EGF accumulative release rate of the experimental group and control group

2.3 hADSCs的形態(tài)學(xué)和增殖曲線

光學(xué)顯微鏡下，hADSCs呈紡錘形，類成纖維細(xì)胞樣；CCK-8法結(jié)果顯示，細(xì)胞可穩(wěn)定增殖15 d以上，在第6天進(jìn)入快速增殖期，于第12天進(jìn)入平臺期（圖 4）。

圖4 hADSCs的形態(tài)學(xué)觀察和增殖曲線Fig.4 Morphology of hADSCs and the proliferation assay

2.4 hADSCs-納米纖維電紡膜復(fù)合物表征

2.4.1 hADSCs-納米纖維電紡膜黏附情況

將hADSCs種植于實驗組和對照組納米纖維電紡膜上，掃描電鏡圖像示第1天時實驗組與對照組細(xì)胞-納米纖維電紡膜黏附均良好，細(xì)胞總表面積/納米纖維電紡膜總表面積相似；第7天時黏附于納米纖維電紡膜上的細(xì)胞相比第1天均有所增加，實驗組細(xì)胞排布更緊密（圖5A-D）。

2.4.2 hADSCs在納米纖維電紡膜上增殖情況

CCK-8法顯示，OD值隨時間推移逐漸增加，證明兩組納米纖維電紡膜均具有良好的生物相容性。實驗組上hADSCs增殖速率快于對照組（圖5E）。

圖5 細(xì)胞-納米纖維電紡膜復(fù)合物黏附情況及細(xì)胞增殖情況Fig.5 The cell-electrospun nanofibrous membrane integrity and the growth curve of hADSCs on the two groups

2.5 電紡膜體外誘導(dǎo)hADSCs向表皮細(xì)胞分化

將hADSCs分別種植于兩組納米纖維電紡膜培養(yǎng)7 d后，實驗組上的hADSCs相比對照組，CK10高表達(dá)，CD105表達(dá)減弱，形態(tài)呈扁圓形，鋪路石樣外觀，胞間連接更為緊密，特征與角質(zhì)形成細(xì)胞相似；而對照組上的hADSCs細(xì)胞不表達(dá)CK10，CD105強(qiáng)表達(dá)，形態(tài)類似于24孔板中培養(yǎng)的hADSCs原有形態(tài)（圖 6）。

圖6 兩組電紡膜誘導(dǎo)hADSCs向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化能力Fig.6 The ability of transferring hADSCs into epithelial cell lineage of experimental group and control group

3 討論

組織工程支架材料可覆蓋皮膚創(chuàng)面，提供力學(xué)支撐，促進(jìn)真皮膠原纖維有序排布，在皮膚缺損愈合中可廣泛應(yīng)用。通過靜電紡絲技術(shù)制備的GT/PCL納米纖維電紡膜，在皮膚組織工程領(lǐng)域已顯示出良好的應(yīng)用前景[11]。龍劍虹等[12]將GT/PCL納米纖維電紡膜應(yīng)用于家兔背部皮膚缺損修復(fù)，觀察到修復(fù)段真皮層肉芽組織增生少，膠原排列規(guī)則。

表皮細(xì)胞的增殖和功能修復(fù)過程更為復(fù)雜，需要多種生物活性因子的動員,是皮膚組織愈合過程中的重點和難點，制備可釋放刺激表皮再生的各種生長因子，從而促進(jìn)表皮愈合的組織工程支架材料成為關(guān)鍵。

文獻(xiàn)表明，應(yīng)用組分包括EGF、胰島素、氫化可的松和RA在內(nèi)的表皮誘導(dǎo)因子復(fù)合體（EIF）可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)表皮生長和加速傷口愈合。能否利用EIF載入改良GT/PCL納米纖維電紡膜的生物學(xué)活性，促進(jìn)種子細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，目前尚無相關(guān)報道。hADSCs是一種從抽脂術(shù)后多余脂肪組織中提取出的一種具有自我更新能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞[13]，可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長，抑制瘢痕形成，對傷口愈合起到促進(jìn)作用[14]，提高皮膚愈合質(zhì)量。因此，我們以hADSCs作為本實驗的種子細(xì)胞。

本實驗對于EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜的研究主要聚焦于以下4個問題。其一，EIF的載入是否改變傳統(tǒng)GT/PCL納米纖維電紡膜原有形貌和力學(xué)特征；其二，載入的EIF能否達(dá)到持久緩釋，從而長期發(fā)揮作用；其三，EIF的載入能否使得hADSCs黏附和增殖情況更佳；其四，EIF的載入能否具有促進(jìn)hADSCs向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用，從而為促進(jìn)表皮細(xì)胞再生提供可能。

我們利用混合靜電紡絲技術(shù)成功制備了EIFGT/PCL納米纖維電紡膜。①大體形貌上，EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜表面光滑平整，無串珠；微觀結(jié)構(gòu)中，納米纖維均勻細(xì)膩，無明顯液相分離，說明EIF充分融合并均勻分布于GT/PCL材料中；納米纖維相互交錯，具有一定的孔隙率，有助于細(xì)胞的黏附、增殖與細(xì)胞外基質(zhì)的釋放；在材料力學(xué)特性上，具有一定的抗拉力和彈性，與傳統(tǒng)GT/PCL納米纖維電紡膜相似，EIF的載入未改變材料原有的優(yōu)良的形貌特征和力學(xué)特性。②通過對EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜中EGF釋放率進(jìn)行分析顯示，EIF能平穩(wěn)釋放15 d以上，使EIF-GT/PCL相較于傳統(tǒng)GT/PCL材料具備長久的藥物釋放能力。③光學(xué)顯微鏡下，24孔板上培養(yǎng)的hADSCs細(xì)胞呈紡錘形，類成纖維細(xì)胞樣；細(xì)胞增殖旺盛，活性較強(qiáng)。將hADSCs作為種子細(xì)胞，接種到兩組納米纖維電紡膜上，經(jīng)過7 d培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖旺盛，EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜相比于GT/PCL納米纖維電紡膜，與hADSCs黏附更佳，hADSCs在其上增殖速度更快，故EIFGT/PCL納米纖維膜是負(fù)載種子細(xì)胞生長的更佳載體；④通過對兩組納米纖維電紡膜上的hADSCs表面標(biāo)志的免疫熒光分析，EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜組上的hADSCs表達(dá)向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化早期標(biāo)志CK10，而間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD105表達(dá)減弱，細(xì)胞形態(tài)扁圓，胞間連接更為緊密，類似于角質(zhì)形成細(xì)胞；而GT/PCL納米纖維電紡膜上的hADSCs不表達(dá)CK10，CD105強(qiáng)表達(dá)。證實了EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜具有在體外誘導(dǎo)hADSCs向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的能力；亦說明EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜中，EIF的活性能夠正常維持，并在原位發(fā)揮作用。

綜上所述，以混合靜電紡絲法制備的EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜理化性能良好，力學(xué)特性和生物相容性佳，具有負(fù)載和維持生長因子活性并平穩(wěn)釋放生長因子，誘導(dǎo)hADSCs向表皮分化的作用，相較于單純GT/PCL納米纖維電紡膜，在修復(fù)皮膚缺損領(lǐng)域擁有更廣闊的應(yīng)用前景。下一步我們將把EIF-GT/PCL納米纖維電紡膜應(yīng)用于動物皮膚缺損模型的修復(fù)中，觀察在體實驗中其促進(jìn)表皮細(xì)胞再生的能力，為制備具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型載藥皮膚組織工程材料提供理論和實驗基礎(chǔ)。