,, ,林嵩,
(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)
真核生物RNA中已發(fā)現(xiàn)的化學(xué)修飾約150種,主要發(fā)生在tRNA、rRNA及其他非編碼RNA上,這些修飾能夠參與真核生物基因表達(dá)的調(diào)控。真核生物mRNA中也存在多種化學(xué)修飾,如5′端帽子N7-甲基鳥嘌呤(N7-methylguanosine,N7-G)、N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)、N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine,m1A)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C)、假尿嘧啶核苷(ψ)和2′-O-甲基化修飾(2′-O-methylation)等,其中m6A是mRNA中最常見的一種修飾[1]。m6A修飾廣泛存在于哺乳動物和植物的mRNA中[2],但由于缺乏m6A特異堿基的檢測技術(shù),其研究較為緩慢,m6A修飾在生物體內(nèi)的具體功能也不清楚。隨著m6A免疫共沉淀高通量測序(MeRIP-seq)技術(shù)的應(yīng)用,m6A的全轉(zhuǎn)錄組水平已在多種生物體內(nèi)被檢測,引起了諸多學(xué)者對m6A分布特征、甲基化和去甲基化動態(tài)調(diào)控以及m6A識別的關(guān)注,并開展了大量的研究工作,m6A的重要生物學(xué)功能也逐漸被人們所認(rèn)識。基于此,綜述了近年來動物和植物中關(guān)于m6A的研究進展,包括m6A的分布特征、動態(tài)調(diào)控、m6A的識別和對mRNA的調(diào)控等,以期全面理解m6A修飾在真核基因表達(dá)調(diào)控和生物體生長發(fā)育中的重要作用。
目前,采用MeRIP-seq技術(shù)已獲得了酵母、人、鼠、擬南芥和水稻的m6A修飾圖譜,結(jié)果顯示,m6A在真核生物mRNA中的分布具有一定的保守性,主要集中在mRNA的終止密碼子附近和3′非編碼區(qū)(UTR),并且存在一致的(G/A)(G/A)AC(A/C/U)甲基化靶序列[3-8]。除3′UTR,m6A在mRNA內(nèi)含子中也存在,表明轉(zhuǎn)錄和甲基化修飾可能同時進行[9]。植物和動物中m6A在mRNA上的分布存在一定的差異,如擬南芥和水稻中m6A修飾除在3′端富集外,也在mRNA5′端翻譯起始位點附近富集[3,5];哺乳動物mRNA中m6A修飾常存在于長外顯子內(nèi),而擬南芥和水稻不具有這一特性[3,7]。哺乳動物大約1/3的轉(zhuǎn)錄本中可以檢測到m6A修飾,每個轉(zhuǎn)錄本中m6A修飾位點數(shù)目也不盡相同,大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本僅存在1~2個m6A修飾位點,而少數(shù)基因則有多個修飾位點[7-8]。植物轉(zhuǎn)錄組中m6A修飾高達(dá)50%,甚至76%[3-5]。
m6A修飾在生物體內(nèi)的分布具有一定的組織特異性,如,哺乳動物中m6A在肝臟、腎臟及大腦中的含量明顯高于其他組織[9];擬南芥的花苞中經(jīng)m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本比例明顯高于根和葉片[4];水稻的愈傷組織和葉片中m6A修飾圖譜也存在明顯差異[5]。這一組織特異性表明,m6A修飾在生物體組織器官的發(fā)育和分化中發(fā)揮一定的功能。
已知DNA和組蛋白存在甲基化/去甲基化動態(tài)可逆修飾過程,從而影響基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能等重要生命過程,現(xiàn)已證明m6A甲基化修飾也是一個動態(tài)可逆的過程,由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶共同調(diào)控這一過程[10-11]。人們形象地將m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶稱為編碼器(Writer),將去甲基化酶稱為消碼器(Eraser)[1]。
RNA中m6A甲基化由復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合體介導(dǎo)完成。METTL3(又稱MTA-70)是第1個被鑒定的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體成員,首先在HeLa細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[10],隨后其同源基因在釀酒酵母、果蠅和擬南芥中被報道[12]。METTL14是m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的另一個核心成員,與METTL3高度同源,可與METTL3發(fā)生互作[12]。在體外METTL3和METTL14形成的異源二聚體比其單個具有更高的甲基轉(zhuǎn)移酶活性,表明兩者可能協(xié)同發(fā)揮甲基化作用[13-14]。研究表明,METTL3具有S-腺苷甲硫氨酸依賴的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性,而METTL14主要負(fù)責(zé)結(jié)合RNA底物[15]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的第3個關(guān)鍵組分是WTAP,在體外它并不影響METTL3/METTL14的甲基轉(zhuǎn)移酶活性,但是WTAP缺失可明顯降低細(xì)胞內(nèi)m6A水平[16-17]。WTAP被認(rèn)為是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基,負(fù)責(zé)招募m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體其他成分結(jié)合到目標(biāo)RNA上[17]。KIAA1429和RBM15(或RBM15B)是新發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的成分。KIAA1429是哺乳動物m6A甲基化所必需的,主要參與mRNA的3′UTR和終止密碼子的甲基化,KIAA1429沉默可降低m6A水平[18]。在人的胚胎腎細(xì)胞中,敲低RBM15和RBM15B可降低m6A水平,破壞XIST介導(dǎo)的基因沉默[19]。免疫共沉淀分析顯示,在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)RBM15和RBM15B可與METTL3互作,并且這一互作依賴WTAP蛋白[20]。最近,另一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL16在人體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),主要負(fù)責(zé)U6 snRNA和MAT2A mRNA的甲基化[15]。
近年來,模式植物擬南芥中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的幾個亞基也已被鑒定。其中,與人的METTL3同源的蛋白質(zhì)為MTA(At4g10760),其等位基因無效突變可引起擬南芥植株胚胎致死[4]。在胚胎特異表達(dá)基因ABI3啟動子作用下表達(dá)MTA可回補mta突變體的致死效應(yīng),植物可開花結(jié)實[21]。擬南芥mta突變體中m6A水平僅為野生型的5%~15%,表明該酶是mRNA m6A甲基化所必需的[21]。擬南芥中與人的METTL14同源蛋白質(zhì)為MTB,mtb突變體的表型與mta類似,如生長延緩、頂端分生組織異常、根生長抑制和向地性異常,這些表型均與m6A水平的降低有關(guān)[22]。擬南芥中FIP37蛋白與人的WTAP同源,可與MTA發(fā)生互作,F(xiàn)IP37突變可引起胚致死和發(fā)育受阻,過表達(dá)FIP37可增加植物毛狀體的分枝[21,23]。MTA和FIP37主要定位于細(xì)胞核,表明m6A修飾主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)[4,23]。
m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的發(fā)現(xiàn)揭示了mRNA中m6A甲基化是一個動態(tài)可逆的過程。FTO和ALKBH5均屬于AlkB家族,是一類雙加氧酶,盡管兩者均可結(jié)合單鏈RNA使m6A去甲基化,但它們的反應(yīng)途徑并不相同,主要的組織定位也不相同。ALKBH5可直接將m6A轉(zhuǎn)變?yōu)锳,F(xiàn)TO則需要催化生成2個中間物hm6A和fm6A之后才使m6A去甲基化[11]。ALKBH5主要在哺乳動物的睪丸中表達(dá),參與精子的形成;FTO主要在腦組織中表達(dá),尤其是神經(jīng)組織中[24]。最近研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)TO主要使mRNA的1號和2號帽子上的m6A脫去甲基[25]。過表達(dá)FTO或ALKBH5的細(xì)胞中m6A水平下降,但是敲低FTO和ALKBH5或敲除兩者之一時,m6A的水平僅略微增加,表明尚有未知的其他去甲基化酶存在,它們可能與FTO和ALKBH5協(xié)同作用[26]。
擬南芥基因組可編碼13個AlkB家族蛋白質(zhì),其中ALKBH9B和ALKBH10B與人的ALKBH5同源,均有m6A去甲基化酶活性[27-28]。敲低ALKBH9B可降低病毒對植物的入侵,但m6A修飾在宿主和病原體互作中的作用機制目前還不清楚[27]。擬南芥alkbh10b缺失突變體表現(xiàn)為開花延遲和生長受到抑制,反之,過表達(dá)ALKBH10B的擬南芥植株出現(xiàn)早花的表型[28],表明m6A可逆甲基化修飾參與植物的花期控制。
與DNA和組蛋白的甲基化相似,m6A修飾的RNA可被特異蛋白質(zhì)或讀碼器(Reader)識別,從而將信息傳遞給下游的應(yīng)答因子。以甲基化的RNA作為探針誘餌,在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了幾個m6A結(jié)合蛋白,如YTHDF2和YTHDF3[8]。隨后其他YTH家族蛋白質(zhì)包括YTHDF1、YTHDC1和YTHDC2也被鑒定[29-30]。生化結(jié)構(gòu)分析表明,YTH家族蛋白質(zhì)在C端具有保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域內(nèi)由幾個色氨酸和酪氨酸殘基構(gòu)成的芳香環(huán)可識別m6A[30-31]。通常,YTHDF1/2被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)m6A讀碼器,YTHDC1為細(xì)胞核內(nèi)m6A讀碼器。最近,研究發(fā)現(xiàn)了一種不含YTH結(jié)構(gòu)域的m6A讀碼器IGF2BP1/2/3,可以提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[32]。
擬南芥有13個含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),包括ECT1—12和CPSF30。SCUTENAIRE等[22]對植物中含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)進行進化分析,發(fā)現(xiàn)YTH結(jié)構(gòu)域均有1個典型的芳香環(huán),因而有一個疏水空穴可以容納并識別m6A。與動物不同的是,植物中YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)并非完全功能冗余,它們與m6A有不同的親和能力[21]。ECT2是新被鑒定的擬南芥中m6A讀碼器,屬于YTH家族蛋白質(zhì),主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),負(fù)責(zé)識別3′非編碼區(qū)的m6A,具有植物特有的m6A識別靶序列UGUA[33]。與野生型擬南芥相比,ect2突變體的毛狀體分枝明顯增加[21,33]。與動物中YTHDF2蛋白促進mRNA降解不同,ECT2提高細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性[33]。隨后發(fā)現(xiàn),ECT3在擬南芥中也有較高的表達(dá)量,并與ECT2共同參與了植物毛狀體的早期發(fā)育過程,ect2ect3雙突變體出現(xiàn)新的表型,延遲第一片真葉的出現(xiàn)[33]。ECT2的同源基因ECT4缺失的突變體第一真葉延遲出現(xiàn)的表型更加明顯,表明ECT2、ECT3和ECT4對維持植物正常的葉片形態(tài)較為重要[33]。
2012—2016年,隨著全轉(zhuǎn)錄組水平m6A檢測技術(shù)的發(fā)展,m6A修飾在許多細(xì)胞活動中的功能研究取得突破。早期的研究預(yù)測到m6A修飾在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用,可能參與mRNA的剪切加工、轉(zhuǎn)運及儲存,甚至影響從mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程。
多個研究證實,m6A修飾可以降低mRNA穩(wěn)定性[7,12,34]。敲低小鼠胚胎干細(xì)胞中的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶基因METTL3或METTL14,m6A水平降低,同時靶向mRNA穩(wěn)定性增加[15,34]。但是DOMINISSINI等[7]比較了非靶向siRNA對照和敲低METTL3的細(xì)胞中m6A修飾的mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)m6A可增強mRNA穩(wěn)定性,可能由于m6A是mRNA正確拼接需要的。另一個研究表明,讀碼器YTHDF2可結(jié)合m6A,并將結(jié)合的mRNA由翻譯裝置運至細(xì)胞質(zhì)處理小體(P-bodies),促進mRNA的降解[35]。ZHANG等[36]研究發(fā)現(xiàn),m6A通過YTHDF2介導(dǎo)Notch1ɑmRNA的穩(wěn)定性,以維持內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化(EHT)過程中內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞基因表達(dá)的平衡,進而調(diào)控造血干細(xì)胞的命運決定。體外研究表明,m6A可能通過阻止mRNA穩(wěn)定因子HuR(Human anigen R)與mRNA的結(jié)合,降低mRNA的穩(wěn)定性[12]。
m6A修飾對植物mRNA穩(wěn)定性的影響尚無定論。LUO等[3]發(fā)現(xiàn),m6A修飾水平與mRNA的豐度存在正相關(guān);而WAN等[4]發(fā)現(xiàn),擬南芥不同組織中m6A修飾水平與mRNA的豐度存在負(fù)相關(guān),間接說明了m6A修飾可降低mRNA穩(wěn)定性。最近的研究表明,擬南芥中m6A的讀碼器ECT2可提高細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性,推測ECT2可能參與m6A介導(dǎo)的3′非編碼區(qū)的可變多聚腺苷酸化[33]。
早期的研究發(fā)現(xiàn),mRNA前體平均含4個m6A位點,而成熟的mRNA平均只有2個位點,表明m6A修飾可能主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi),內(nèi)含子的剪切導(dǎo)致成熟mRNA中m6A修飾的減少[37];應(yīng)用PAR-CLIP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),METTL3的結(jié)合位點主要是在內(nèi)含子內(nèi)[17];在能產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄本的基因中,METTL3的結(jié)合位點和m6A修飾位點明顯高于只有1個轉(zhuǎn)錄本的基因,表明m6A修飾與mRNA拼接及可變剪切關(guān)系密切[17]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體METTL3/METTL14/WTAP、去甲基化酶FTO和ALKBH5及m6A讀碼器YTHDF2和YTHDC1主要定位或部分定位于mRNA前體拼接的主要亞核結(jié)構(gòu)——核斑點(Nuclear speckles)[38],表明m6A在mRNA拼接中可能發(fā)揮調(diào)控作用。敲低METTL3或WTAP會產(chǎn)生不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本,且現(xiàn)已知WTAP是一種拼接因子[16,39]。動物中,ALKBH5可影響拼接效率[24]。RNA結(jié)合蛋白HNRNPC負(fù)責(zé)mRNA前體加工和可變剪切,最近研究表明,m6A介導(dǎo)的mRNA結(jié)構(gòu)重排可影響HNRNPC與mRNA的結(jié)合[39],且mRNA的這種結(jié)構(gòu)重排常常在外顯子附近調(diào)控拼接。在敲除FTO的3T3-L1前脂肪細(xì)胞中,伴隨5′和3′側(cè)翼區(qū)m6A水平的增加,RNA結(jié)合拼接因子SRSF2的能力增加,其靶向外顯子的概率增加[40]。體外試驗表明,mRNA前體的拼接因子SRSF3和SRSF10可競爭性地與核讀碼器YTHDC1結(jié)合,而在體內(nèi)YTHDC1可通過促進SRSF3、抑制SRSF10在核斑點的定位及與pre-RNA的結(jié)合參與調(diào)控mRNA的拼接[30]。
mRNA是蛋白質(zhì)合成的直接模板,m6A在起始密碼子、外顯子和終止密碼子附近的富集表明,其可能參與蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控。最近研究表明,m6A讀碼器YTHDF1可與蛋白質(zhì)合成起始因子eIF3互作,提高經(jīng)m6A修飾的mRNA的翻譯效率[33]。隨后研究顯示,細(xì)胞受到脅迫如熱休克時mRNA 5′UTR的m6A修飾增多并伴隨著翻譯效率的提高[41]。另一研究表明,METTL3可通過直接與翻譯起始因子eIF3互作促進mRNA的翻譯,而不依賴METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶活性或與YTHDF1或YTHDF2的結(jié)合[42]。但是最近一些體外翻譯和報告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究表明,腺苷甲基化會導(dǎo)致翻譯效率降低[43]。盡管m6A修飾不影響堿基配對,CHOI等[44]利用大腸桿菌核糖體系統(tǒng)并結(jié)合生化、結(jié)構(gòu)和單分子的方法研究m6A修飾在mRNA/tRNA互作時發(fā)現(xiàn),m6A修飾可干擾tRNA的選擇和翻譯的延伸,且這種干擾依賴密碼子內(nèi)m6A修飾所在的位置及密碼子的序列,進而影響蛋白質(zhì)的翻譯。因此,m6A對不同mRNA翻譯的影響可能有所不同。
目前,多個物種的m6A全轉(zhuǎn)錄組圖譜已被揭示,但要進行精確定位和定量分析仍需位點特異轉(zhuǎn)錄圖譜,而測序技術(shù)仍需不斷探索改進。近年來,動物中參與m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的組分陸續(xù)被鑒定,但m6A編輯復(fù)合體的確切組成、調(diào)控和保守性尚未完全研究清楚。此外,研究表明,并非所有的mRNA均發(fā)生甲基化,且并非所有潛在的共有靶序列均發(fā)生甲基化,m6A選擇性的機制及調(diào)控基礎(chǔ)目前還不清楚。動物中已發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶主要有FTO和ALKBH5,但研究表明可能還有其他去甲基化酶的存在,有待進一步鑒定。m6A的讀碼器主要是一類含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),該類蛋白質(zhì)在哺乳動物中已被發(fā)現(xiàn)5個,此外新發(fā)現(xiàn)的不含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)IGF2BP1/2/3也可結(jié)合m6A,因此可能還有其他的含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)或不含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠結(jié)合識別m6A,這有待證實。與動物相比,植物mRNA中m6A修飾研究還僅僅處于一個起始階段,m6A修飾僅在擬南芥和水稻中被報道,植物mRNA中m6A修飾的分布特點、甲基轉(zhuǎn)移酶的組分、去甲基化酶及識別蛋白均需進行大量研究。
已知m6A修飾是一個動態(tài)可逆的過程,什么情況下m6A修飾受動態(tài)調(diào)控;在生物體的不同發(fā)育階段或者病理、逆境脅迫下,基因表達(dá)的調(diào)控是否依賴于甲基化的轉(zhuǎn)錄本;從整個表觀遺傳學(xué)角度看,RNA修飾如何與DNA甲基化、組蛋白修飾協(xié)同作用調(diào)控基因的表達(dá),都有待于進一步探討。