李春靜，張 杰，祝雅晨，孔祥會(huì)

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的提高，集約化養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，水產(chǎn)養(yǎng)殖種類不斷增多，養(yǎng)殖水環(huán)境也進(jìn)一步惡化，發(fā)病率的明顯升高給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中激素、抗生素、化學(xué)合成藥物等應(yīng)用普遍。但由于漁藥的不合理使用，尤其是抗生素類藥物的濫用，導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生耐藥性，養(yǎng)殖魚類免疫力降低和環(huán)境受到污染；此外，藥物殘留使水產(chǎn)品的品質(zhì)下降。因此，研發(fā)和應(yīng)用低毒、高效、低殘留的中草藥是水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控的重要選擇[1]。

天然中草藥具有獨(dú)特的抗微生物和寄生蟲的抗菌驅(qū)蟲作用，無有害殘留及不易使水產(chǎn)品產(chǎn)生耐藥性等，毒副作用小。中草藥免疫活性物質(zhì)主要分為多糖、苷類、生物堿、有機(jī)酸、揮發(fā)性油等[2]。研究表明，將一些中草藥單獨(dú)或按比例混合使用可以促進(jìn)魚體生長(zhǎng)發(fā)育；降低飼料系數(shù)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[3]；改善腸道菌群的組成[4]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]。但是，中草藥成分復(fù)雜，直接使用并不能確定單一的有效成分，科研人員轉(zhuǎn)而研究中草藥的活性成分，探討中草藥主效成分及其作用機(jī)理。

黃芪(Astragalusmembranaceus)作為一種促生長(zhǎng)和提高水產(chǎn)品品質(zhì)的水產(chǎn)飼料添加劑，其作用及相關(guān)機(jī)理逐漸被人們揭示，但仍有許多方面值得深入研究。研究證明，在飼料中添加黃芪多糖(APS)可不同程度地提高動(dòng)物超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、溶菌酶等酶活力[6-7]，且其活性與給藥劑量呈正相關(guān)；黃芪多糖可以提高動(dòng)物的抗病能力[8-9]，但是對(duì)動(dòng)物免疫的增強(qiáng)作用與黃芪多糖添加水平之間并非線性關(guān)系；黃芪多糖能抑制維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)引起的鯽魚(Carassiusauratus)細(xì)胞凋亡[10]。這些研究結(jié)果從個(gè)體以及細(xì)胞層面證明了黃芪多糖可以提高動(dòng)物的特異性和非特異免疫及抗病性。筆者總結(jié)近年來黃芪多糖在水產(chǎn)動(dòng)物抗病中的研究應(yīng)用效果，以作為今后開展黃芪多糖研究和防病應(yīng)用的理論依據(jù)。

1 黃芪多糖

1.1 黃芪多糖的特征

黃芪毒副作用小，價(jià)格低，不易產(chǎn)生抗藥性，作為一種補(bǔ)益中草藥添加劑迄今已應(yīng)用逾2000年。1943年多糖作為藥物開始使用，1981年黃芪多糖首次被提取分離，其分子式為C10H7ClN2O2S[11]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，是黃芪干燥的根經(jīng)提取、濃縮和純化而成的水溶性多糖，具有抗病毒、抗疲勞、抗衰老、抗菌等功能[12-14]，能綜合性地提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，延長(zhǎng)抗體作用時(shí)間，并能誘生干擾素，起到抗病毒的作用[15]。

多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，單糖的組成對(duì)多糖活性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于糖苷鍵和單糖連接方式[16]。研究發(fā)現(xiàn)，組成黃芪多糖的單糖為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖；在構(gòu)成黃芪多糖的單糖中，甘露糖是主要成分，其次是葡萄糖[17]。黃芪多糖包括3個(gè)亞型: APSⅠ、APSⅡ和APSⅢ。APSⅠ為由D-葡萄糖、D-半乳糖及L-阿拉伯糖構(gòu)成的雜多糖，其平均相對(duì)分子質(zhì)量為36.3 ku；APSⅡ和APSⅢ均為葡聚糖，多以α-(1→4) 鍵連接，少數(shù)以α-(1→6) 鍵鏈接[18]。劉星堦等[19]從膜莢黃芪中獲得黃芪多糖，由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1∶0.95∶0.70。鄒一愚等[20]采用乙醇沉淀法將分級(jí)得到兩組分APSⅠ和APSⅡ，兩者之比為0.31∶0.69；APSⅡ中葡萄糖含量明顯低于APSⅠ，且APSⅠ中不含半乳糖和阿拉伯糖，但木糖含量很高。說明黃芪多糖中大分子量部位含有大量戊糖，而小分子量部位則以葡萄糖和半乳糖為主。以上研究證實(shí)，黃芪多糖的單糖組成和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)由于提取的品種和工藝不同差異很大。

1.2 黃芪多糖提取方法

黃芪多糖可通過多種方式從黃芪中提取，主要有水提取法、堿醇提取法、酶解法、超聲波浸提法、微波提取法、組織破碎提取法、超高壓提取法和超濾法。丁利君等[21]分別比較了水浴浸提法、超聲波浸提法和微波浸提法等多種方法提取黃芪多糖的效果，發(fā)現(xiàn)水浴浸提法提取率最高。用微波萃取技術(shù)從蒙古黃芪干燥根中萃取黃芪多糖[22]，測(cè)得的相對(duì)分子量為11 ku，純度達(dá)97.16%；用紅外光譜、13C核磁共振和1H核磁共振技術(shù)確定試驗(yàn)所得黃芪多糖主鏈由葡萄糖以α-型糖苷鍵連接而成。劉星堦等[19]通過水提法再經(jīng)柱層析洗脫獲得黃芪多糖，初步純化得粗多糖，再進(jìn)一步純化得平均分子質(zhì)量為37.5 ku的白色粉末狀黃芪多糖。目前黃芪多糖的提取主要還是以傳統(tǒng)的水提法和酶解法為主，但有研究表明，將傳統(tǒng)方法與超濾等現(xiàn)代化工藝相結(jié)合，可提高黃芪多糖的純度以及提取率。

1.3 黃芪多糖的安全性

黃芪多糖急性和亞慢毒性試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠行為及各組織(心臟、肺、肝臟、腎臟)均正常，未發(fā)現(xiàn)任何毒副反應(yīng)[23]，表明黃芪多糖對(duì)動(dòng)物是安全的。吳旋等[24]急性毒性試驗(yàn)表明，黃芪多糖對(duì)金絲魚(Tanichthrsaltbonubes)的96 h 半數(shù)致死質(zhì)量濃度高達(dá)2394.89 mg/L，表明較高劑量使用黃芪多糖也是安全的。試驗(yàn)證明，以推薦劑量(日添加10 mg/kg)、3倍推薦劑量、5倍推薦劑量連續(xù)21 d投喂草魚(Ctenopharyngodonidella)，分階段采取試驗(yàn)草魚全血及血清進(jìn)行臨床病理學(xué)檢測(cè)和組織病理切片。結(jié)果表明，黃芪多糖喂養(yǎng)的草魚未見細(xì)胞及組織上的異常。以推薦劑量投喂黃芪多糖養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物安全可靠，即使達(dá)到5倍的推薦劑量時(shí)，也沒有安全性問題[25]。由此可見，黃芪多糖可以作為一種安全、有效的免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并且對(duì)人體無毒害。

2 黃芪多糖的抗病作用機(jī)理

2.1 黃芪多糖可促進(jìn)免疫器官的發(fā)育

與哺乳動(dòng)物免疫器官組成不同，魚類沒有骨髓和淋巴結(jié)，頭腎為主要的造血器官。魚類免疫器官與組織主要指腎臟、脾臟、胸腺以及消化道淋巴組織與小淋巴細(xì)胞等；黏膜淋巴組織也是其免疫系統(tǒng)的重要組成部分[26]。

黃芪多糖能夠促進(jìn)動(dòng)物胸腺、骨髓、脾臟的質(zhì)量增加和發(fā)育，而免疫器官的質(zhì)量和發(fā)育會(huì)直接影響機(jī)體免疫力[27]。林旋等[28]在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量黃芪多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可促進(jìn)魚體免疫器官的發(fā)育和成熟，從而提高魚體免疫力；黃芪多糖作用效果隨著添加量的升高而增強(qiáng)。在鯉魚(Cyprinuscarpio)的研究中也有相似的結(jié)果，飼料中添加1%的黃芪多糖，能夠明顯提高鯉魚胸腺、頭腎和脾臟的質(zhì)量，增強(qiáng)鯉魚免疫機(jī)能[29]。黃芪多糖能有效增加免疫器官質(zhì)量，促進(jìn)部分臟器的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；大量研究數(shù)據(jù)也表明，黃芪多糖可提高水產(chǎn)動(dòng)物的質(zhì)量增加率以及飼料的利用率。

2.2 黃芪多糖可促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)及分泌

細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。它通過結(jié)合細(xì)胞表面相應(yīng)的細(xì)胞因子受體而發(fā)揮生物學(xué)作用。近年來，魚體內(nèi)檢出和推斷存在的細(xì)胞因子多達(dá)幾十種，研究較為深入的兩類魚類細(xì)胞因子是IL-1β[30-31]和TNF-α[32]，前者作為一種多效促炎細(xì)胞因子，在炎癥過程中起著重要作用，可以通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、相關(guān)組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)控免疫；TNF-α可增強(qiáng)吞噬作用、趨化作用以及溶菌酶合成等多種細(xì)胞反應(yīng)。鯉魚注射不同劑量黃芪多糖后，檢測(cè)其細(xì)胞因子和免疫相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對(duì)IL-1β在鰓和脾臟的表達(dá)沒有顯著提升，但高劑量黃芪多糖可促進(jìn)TNF-α在鰓和脾臟中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，低劑量和中等劑量的黃芪多糖分別可以促進(jìn)C型溶菌酶在鰓和脾臟中的表達(dá)；并且頭腎中IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)量隨黃芪多糖劑量的增加而升高[33]。腹腔注射黃芪多糖，可誘導(dǎo)C型溶菌酶在吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)鰓、頭腎、肝臟和脾臟等組織中的表達(dá)[34]。攝食添加黃芪多糖飼料的鯽魚，其肝臟、脾臟、腎臟中總一氧化氮合酶、一氧化氮、誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶含量明顯高于未添加組[29]。這些結(jié)果表明，雖然黃芪多糖的抗病作用受多因素相互調(diào)節(jié)的，但是促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而提高魚類免疫仍作為其抗病機(jī)能的重要部分。

2.3 黃芪多糖可提高非特異性免疫能力

非特異性免疫是動(dòng)物在進(jìn)化過程中所形成的抵御抗原微生物侵入及殺滅、吞噬病原微生物的免疫能力，具有先天性和可遺傳性。

2.3.1 吞噬作用

巨噬細(xì)胞是魚類最重要的免疫活性細(xì)胞之一，其在識(shí)別、吞噬外來病原微生物，處理和呈遞抗原，激活淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答以及分泌免疫因子等方面發(fā)揮重要作用[35-37]。黃芪多糖作用于離體培養(yǎng)的鯉魚頭腎巨噬細(xì)胞，可顯著提高巨噬細(xì)胞的氧、氮呼吸暴發(fā)活性[38]。黃芪水提取液?jiǎn)为?dú)使用時(shí)能刺激鯉魚頭腎中巨噬細(xì)胞增殖，卻不能刺激巨噬細(xì)胞的氧、氮暴發(fā)活性[39]。白東清等[40]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠有效地提高黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)吞噬細(xì)胞的吞噬活性，并且隨黃芪多糖添加水平的添加而升高，用遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)攻毒后死亡率相比對(duì)照組顯著降低。

白細(xì)胞具有趨化性，當(dāng)病原體侵入或自身組織壞死時(shí)，通過胞吞作用吞噬異物，其吞噬能力是魚類非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一[41]。在羅非魚[28]基礎(chǔ)日糧中添加100、500、1000 mg/kg和1500 mg/kg黃芪多糖，試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖可以不同程度地提高羅非魚血液中白細(xì)胞的吞噬能力，第40 d時(shí)，1500 mg/kg黃芪多糖對(duì)白細(xì)胞的吞噬能力提高至112%。Ardó等[42]研究結(jié)果同樣表明，黃芪多糖可明顯提高尼羅羅非魚(O.niloticus)白細(xì)胞吞噬活性。相似的結(jié)果在大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[43]中也有發(fā)現(xiàn)。用不同劑量(100、150、200、250 mg/kg)的黃芪多糖投喂雜交鲌，30 d后250 mg/kg組鲌的白細(xì)胞吞噬活性提高最為顯著，并且用嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)攻毒發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能提高雜交鲌的免疫保護(hù)率[44]。以上研究結(jié)果與哺乳動(dòng)物中的結(jié)果相似[45]，表明黃芪多糖可通過識(shí)別巨噬細(xì)胞表面受體，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，影響巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

2.3.2 抗氧化作用

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽在細(xì)胞自由基損傷中起著關(guān)鍵作用[46]。黃芪多糖可以提高超氧化物歧化酶活性及總抗氧化能力[47]，對(duì)OH-和O2-自由基有清除作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，與黃芪多糖劑量呈正相關(guān)性[21]。Zahran等[48]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可提高尼羅羅非魚超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、溶菌酶活性及丙二醛含量。樊英等[49]也發(fā)現(xiàn)，添加3%和5%黃芪多糖微膠囊可以提高仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔液中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、髓過氧化物酶活性；用燦爛弧菌(Vibriosplendidus)攻毒后對(duì)仿刺參的免疫保護(hù)率可分別達(dá)到66.67%和69.44%。在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)飼料中添加黃芪多糖時(shí)，添加600 mg/kg黃芪多糖能顯著提高鰓黏液中溶菌酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，提高機(jī)體的非特異性免疫能力[50]；在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[51]中也有相似報(bào)道。同時(shí)，在齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[3]、黃顙魚[43]、草魚[52]、鯽魚[53]、雜交鱧(Channamaculate♀×C.argus♂)[54]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[55]、中華鱉(Pelodiscussinensis)[56]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[57]以及凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[58-59]中均發(fā)現(xiàn)有相似的結(jié)果。目前關(guān)于多糖的抗氧化作用機(jī)制主要有兩種解釋，一種是OH-可以奪取多糖碳?xì)滏溕系臍湓咏Y(jié)合成水，而多糖碳原子上留下單電子可繼續(xù)氧化形成過氧自由基，后者可進(jìn)一步分解；另一種是多糖環(huán)上的羥基可與產(chǎn)生OH-等所必需的金屬離子絡(luò)合，從而抑制活性氧自由基的產(chǎn)生[60-61]。無論是哪種機(jī)制，黃芪多糖都可通過激活體內(nèi)多種酶活性，及時(shí)清除自由基，減少氧化應(yīng)激，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力。

3 黃芪多糖的應(yīng)用

隨著黃芪多糖作用機(jī)理的深入研究，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也得到了廣泛應(yīng)用。中藥多糖主要通過注射法、灌注法、浸泡法和飼料投喂法等方式應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，但是由于水產(chǎn)養(yǎng)殖數(shù)量龐大，因此一般作為免疫增強(qiáng)劑添加到飼料中改善腸道菌群的組成，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，促進(jìn)魚體生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)魚體免疫力[62]。目前，水產(chǎn)動(dòng)物病害仍以細(xì)菌性疾病為主，各種水生病原菌作為主要傳染性疾病病原，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失；嗜水氣單胞菌能引起許多淡水魚類的細(xì)菌性出血病，其傳播速度快、發(fā)病范圍廣，是淡水魚類暴發(fā)性傳染病最主要的病原菌之一。在日糧中添加不同含量的黃芪多糖，可以提高細(xì)菌感染的鯉魚[63]、黃顙魚[64]以及大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[65]等的存活率。白斑綜合征病毒是對(duì)蝦養(yǎng)殖中危害最大的一類病毒，可使對(duì)蝦短時(shí)間內(nèi)大量死亡。凡納濱對(duì)蝦注射白斑綜合征病毒后，與對(duì)照組相比，0.2 g/kg 黃芪多糖顯著提高對(duì)蝦成活率，可見黃芪多糖能增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦抵抗白斑綜合征病毒的感染能力[66]。同時(shí)，周智愚等[67]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠提高草魚母本免疫能力并向子代垂直傳遞，在應(yīng)對(duì)草魚呼腸孤病毒感染時(shí)發(fā)揮一定免疫保護(hù)作用。研究表明，在飼料中添加黃芪多糖，可以增加羅非魚腸絨毛的長(zhǎng)度[48]，增強(qiáng)其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；降低氧化損傷，提高抗氧化能力以及對(duì)肝組織保護(hù)作用[63]。水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控原則“防治結(jié)合，防重于治”，因此要主動(dòng)發(fā)揮黃芪多糖對(duì)疾病的預(yù)防作用，同時(shí)也要加強(qiáng)對(duì)疾病治療作用的研究。

4 總結(jié)與展望

中草藥可增加不同魚類和貝類對(duì)細(xì)菌、病毒和寄生蟲的特異性和非特異性免疫能力[68]，在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為控制水產(chǎn)動(dòng)物疾病發(fā)生的重要漁藥。中草藥黃芪不僅具有抗病和促生長(zhǎng)作用，而且無任何毒副作用。黃芪多糖作為一種重要活性成分，可通過激活免疫細(xì)胞功能而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。水產(chǎn)動(dòng)物中黃芪多糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬功能，也可促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，抑制病毒繁殖。但是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的黃芪多糖多為粗多糖，多以免疫佐劑或飼料添加劑應(yīng)用，研究還不夠深入。今后，黃芪多糖研究的重點(diǎn)應(yīng)集中于：(1)利用現(xiàn)代化技術(shù)方法，對(duì)黃芪多糖進(jìn)行提取分離，利用先進(jìn)的研究方法對(duì)黃芪多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，為黃芪多糖的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；(2)深入研究黃芪多糖作用機(jī)理，理解其免疫增強(qiáng)的作用；(3)加強(qiáng)黃芪多糖與其他中草藥成分的配伍及其協(xié)同作用研究，研發(fā)出高效的抗病中草藥合劑，以使其更好地應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控，從而減少疾病造成的漁業(yè)損失。