張雨，王可洲，郭中坤，聶愛(ài)蕊

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

張雨，王可洲，郭中坤，聶愛(ài)蕊

250200 濟(jì)南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（張雨、王可洲、郭中坤、聶愛(ài)蕊）；250002 濟(jì)南，山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）（張雨、王可洲、郭中坤、聶愛(ài)蕊）；276023 山東，臨沂市第三人民醫(yī)院藥劑科（聶愛(ài)蕊）

腫瘤的治療依舊是醫(yī)學(xué)上的難題，由于其發(fā)生發(fā)展復(fù)雜，往往伴隨著免疫逃逸和免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成，且腫瘤細(xì)胞易于擴(kuò)散和遷移[1]。因此，阻止腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸是一項(xiàng)重要的治療途徑。腫瘤免疫治療是指通過(guò)增強(qiáng)特異性免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的防御能力，并阻遏其他調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的保護(hù)作用[2]，從免疫防御的角度來(lái)控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及擴(kuò)散。腫瘤免疫療法的出現(xiàn)備受關(guān)注，是癌癥治療領(lǐng)域的最具前景的研究方向，更多的腫瘤免疫治療藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段及市場(chǎng)，使癌癥的治療有了新的選擇。另外，為加強(qiáng) T 細(xì)胞的特異性免疫原性而對(duì)其進(jìn)行基因修飾以提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的研究方法已取得了重大的進(jìn)展[3]。

基因編輯技術(shù)是對(duì)某一核苷酸序列中的特定基因位點(diǎn)進(jìn)行人為改變，插入、刪除、替換或修飾基因組中的特定目的基因使其表達(dá)性狀改變的一種新興分子生物技術(shù)[4]。簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR 相關(guān)基因 9（CRISPR-associated genes 9，Cas9）作為一種新興的基因編輯技術(shù)，具有簡(jiǎn)單高效的靶向基因編輯能力，被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域[5]，并極大促進(jìn)了腫瘤免疫治療研究的發(fā)展。本文就 CRISPR/Cas9 技術(shù)的背景、原理及此基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，討論基因編輯技術(shù)在此領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 CRISPR/Cas9 基因編輯原理

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種普遍存在于古細(xì)菌和細(xì)菌基因組中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[6]，其序列特點(diǎn)最先于 1987 年由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)。直到 2008 年該系統(tǒng)才被研究證明能夠以類似于真核細(xì)胞中 RNA 干擾（RNAi）的方式抵御外源微生物或質(zhì)粒的侵襲[7]。2012 年，由 RNA 介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù) CRISPR/Cas9 正式建立，并完成了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因組編輯[8]。

CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)是根據(jù)II型原核生物的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)演變而來(lái)[9]。Cas9 蛋白能夠結(jié)合人工改造的單鏈向?qū)?RNA（single guide RNA，sgRNA）形成核糖核蛋白，在 sgRNA 的引導(dǎo)下靶向識(shí)別基因組的目標(biāo)系列[10]。傳統(tǒng)的噬熱鏈球菌改造出的 spCas9 蛋白需要基因組靶目標(biāo)序列上游存在NGG（其中 N 為任意核苷酸）的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的結(jié)構(gòu)序列[11]。Cas9-sgRNA 與基因組靶標(biāo)序列形成三元復(fù)合物之后，Cas9 蛋白的兩個(gè) DNA 酶結(jié)構(gòu)域能夠切割 DNA 的磷酸酯鍵，最終形成的雙鏈斷裂損傷（double stranded break，DSBs）會(huì)激發(fā)細(xì)胞自身的兩種 DNA 損傷修復(fù)機(jī)制：同源重組修復(fù)機(jī)制（homology directed repair，HDR）和非同源重組末端直接連接修復(fù)機(jī)制（non-homologous end joining，NHEJ）[12]。HDR 修復(fù)一般是在外源同源供體 DNA 存在的前提下對(duì) DSB 進(jìn)行同源重組修復(fù)，人工設(shè)計(jì)外源的單鏈或雙鏈供體 DNA 可以敲入和輔助大片段敲除靶標(biāo)序列或構(gòu)建點(diǎn)突變[13]。NHEJ 修復(fù)途徑不依靠同源重組方式，而是依靠相關(guān)蛋白介導(dǎo)直接斷裂雙鏈直接連接修復(fù)，但易產(chǎn)生插入缺失突變或移碼突變，非同源重組末端直接連接修復(fù)機(jī)制途徑是常用的對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行敲除的修復(fù)途徑[14]。CRISPR 基因編輯技術(shù)出現(xiàn)后便很快地被應(yīng)用于多種細(xì)胞水平和模式生物個(gè)體水平中的基因編輯，利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)并結(jié)合大規(guī)模庫(kù)篩方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的快速篩選和研究[15]。

CRISPR/Cas9 技術(shù)作為第三代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)，屬于 Cas 系統(tǒng)中最便捷的技術(shù)。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的編輯原理現(xiàn)在還沒(méi)有明確的解釋，但其編輯途徑大致可分為三個(gè)步驟來(lái)完成[16]，首先是 CRISPR 高度可變的間隔區(qū)的獲得，然后是 CRISPR 基因座的表達(dá)，最后是此 CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)發(fā)揮活性或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干預(yù)。

以細(xì)菌抵抗外源微生物感染時(shí)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)防御機(jī)制為例說(shuō)明，主要有以下三個(gè)階段[17]：①適應(yīng)：CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中的 Cas1、Cas2 協(xié)助其他相關(guān) Cas 蛋白使外源微生物基因組中的某特定片段定點(diǎn)整合到 CRISPR位點(diǎn)第一個(gè)重復(fù)序列之前，前導(dǎo)區(qū)之后，在之后的復(fù)制中作為一個(gè)新的間隔序列存在；②表達(dá)：前導(dǎo)序列介導(dǎo) CRISPR 轉(zhuǎn)錄為 pre-crRNA 時(shí)，其 5' 端的 tracrRNA 同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與 pre-crRNA 構(gòu)成 RNA 二聚體，在Cas9 和RNAaseIII的協(xié)同作用下剪切成為成熟的 crRNA/tracrRNA 二聚體；③干擾：成熟的crRNA/tracrRNA 二聚體通過(guò)堿基互補(bǔ)原則識(shí)別外源微生物基因組中的靶目標(biāo)位點(diǎn)，在 Cas9 蛋白核酸酶的引導(dǎo)下剪切該靶標(biāo)位點(diǎn)的 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，從而使外源微生物失活。

經(jīng)過(guò)人工改造后的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的操作原理與此類似[18]，在形成 crRNA/tracrRNA 二聚體時(shí)的 crRNA 編碼序列中被人為目的基因特定位點(diǎn)的序列替換，從而構(gòu)建成能夠介導(dǎo) Cas9 蛋白定點(diǎn)切割目的基因 DNA 特定位點(diǎn)的sgRNA[19]。在 Cas9 蛋白剪切目的基因的 DNA 雙鏈之后形成 DSBs，并激活細(xì)胞的 HDR 和 NHEJ 兩種自我修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的插入、敲除及改造修飾等基因編輯方式。

2 CRISPR/Cas9 在抗腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

2.1 CAR-T 細(xì)胞免疫療法

CRISPR/Cas9 技術(shù)在腫瘤免疫治療方面發(fā)揮著重要的作用，其在基因治療上最大的突破是促進(jìn)了腫瘤臨床治療的研究進(jìn)展。在諸多腫瘤免疫療法中，CAR-T 細(xì)胞免疫療法是最熱點(diǎn)的研究?jī)?nèi)容，其全稱為嵌合抗原受體 T 細(xì)胞免疫療法[20]。CAR-T 技術(shù)通過(guò)基因編輯獲得修飾后的 T 細(xì)胞，能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面特異性受體，并增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的防御能力[21]。CAR-T 療法是通過(guò)采集患者的 T 細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，成為 CAR-T 細(xì)胞后輸入患者體內(nèi)，過(guò)程用時(shí)長(zhǎng)、難度高且成本大，還有 T 細(xì)胞自身的治療數(shù)量限制[22]。而 CRISPR/Cas9 技術(shù)能明顯提高 CAR-T 細(xì)胞的制備效率，首先對(duì)一個(gè)正常的免疫 T 細(xì)胞進(jìn)行基因改造，在引入 CAR 序列時(shí)去除 T 細(xì)胞內(nèi)源性 αβT 細(xì)胞受體基因和人白細(xì)胞抗原 I（human leukocyte antigen I，HLA I）類編碼基因[23]，防止用于不同患者時(shí)產(chǎn)生抗宿主反應(yīng)。另外，CRISPR/Cas9 技術(shù)也可以通過(guò)敲除編碼信號(hào)分子的基因或 T 細(xì)胞抑制性受體的基因來(lái)提高 CAR-T 細(xì)胞的功能。CAR-T 細(xì)胞療法的抗腫瘤療效顯著，但只能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面受體，而腫瘤特異性 T 細(xì)胞受體（TCR-T）細(xì)胞能夠通過(guò)基因修飾表達(dá)特異性受體，識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面經(jīng) I 類主要組織相容性抗原呈遞的抗原肽從而識(shí)別胞內(nèi)特異性分子[24]。但受體 T 細(xì)胞中存在的內(nèi)源性 TCR 與修飾后的 TCR 可能會(huì)存在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，因此采用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)制備 TCR、HLA I 類分子和 PD1 缺失的 CAR-T 細(xì)胞，使其異體反應(yīng)降低又不引起抗宿主疾病，體內(nèi)抗腫瘤療效也得以提升。

CRISPR 技術(shù)在應(yīng)用于 CAR-T 細(xì)胞的基因修飾方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。但存在兩個(gè)限制性問(wèn)題[25]：一是 CRISPR 技術(shù)導(dǎo)入 T 細(xì)胞的方法不能使普通細(xì)胞正常增殖，限制了細(xì)胞培養(yǎng)和富集過(guò)程。導(dǎo)入方法中，非整合轉(zhuǎn)染方法雖安全但效率低，整合轉(zhuǎn)染的方法效率較高但其安全性不能保證。二是 CRISPR 編輯系統(tǒng)存在脫靶現(xiàn)象，一旦發(fā)生脫靶，將導(dǎo)致非靶標(biāo)基因的改變或調(diào)控元件的破壞，會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的后果。因此 CAR-T 細(xì)胞的精確編輯和高效導(dǎo)入是基因編輯技術(shù)未來(lái)主要的研究方向。

2.2 免疫檢查點(diǎn)阻斷療法

程序性死亡分子 PD-1 和細(xì)胞毒 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）等免疫分子的變化影響 T 細(xì)胞的活化，使腫瘤細(xì)胞易于逃逸機(jī)體免疫機(jī)制，導(dǎo)致 T 細(xì)胞治療效果較差。為了更好發(fā)揮 T 細(xì)胞腫瘤治療的療效，利用免疫檢查點(diǎn)的阻斷抗體可阻斷免疫調(diào)節(jié)物對(duì) T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答抑制[26]，有效提高其免疫功能。另外，通過(guò) CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除參與免疫負(fù)調(diào)節(jié)的基因，達(dá)到同樣的抗腫瘤效果，是一種全新的治療思路。利用電穿孔方法[27]將 Cas9 和 sgRNA 導(dǎo)入 T 細(xì)胞并敲除 PD-1 基因，使其表達(dá)減少，長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn) PD-1 對(duì) T 細(xì)胞活化的影響，使 T 細(xì)胞更好地發(fā)揮其抗腫瘤療效。這種新的阻斷療法常常與過(guò)繼性 T 細(xì)胞免疫療法結(jié)合使用[28]，可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性?？茖W(xué)家運(yùn)用 CRISPAR /Cas9 技術(shù)有效地對(duì) CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，得到多基因敲除 CAR-T 細(xì)胞，防止免疫調(diào)節(jié)物對(duì) T 細(xì)胞活化與增殖的影響，成功提高 CAR-T 細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的防御作用，更好地發(fā)揮抗腫瘤療效。

2.3 抗體靶向療法

正是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面表達(dá)了與正常細(xì)胞不同的抗原，因此這些抗原可以作為單克隆抗體識(shí)別的靶點(diǎn)，被抗體識(shí)別并結(jié)合，引起腫瘤細(xì)胞的死亡，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。目前，F(xiàn)DA 已批準(zhǔn)的抗體類藥物有許多，如抗 HER2 抗體、抗 CD20 抗體、抗 VEGF 抗體等。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可以用來(lái)鑒定腫瘤細(xì)胞表面的潛在特異性靶點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)展抗體的靶向治療應(yīng)用。Steinhart 等[29]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在具有 RNF43 突變的胰腺導(dǎo)管腫瘤細(xì)胞之間進(jìn)行全基因組篩查，發(fā)現(xiàn) Frizzled-5 受體在胰腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用。特異性結(jié)合 Frizzled-5 的抗體能夠明顯抑制荷瘤小鼠中癌細(xì)胞的增殖，表明 Frizzled-5 或成為免疫治療藥物研究的新方向。

另外，CRISPR/Cas9 不僅可以鑒別腫瘤細(xì)胞表面特異性靶點(diǎn)，同時(shí)也在抗體的制備中發(fā)揮著作用。根據(jù)抗體重鏈 C 區(qū)氨基酸組成不同，對(duì)應(yīng)的抗體可分為 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE 五類，在激活補(bǔ)體系統(tǒng)、激活效應(yīng)細(xì)胞以及對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用方面這五類抗體均存在差異，在腫瘤的抗體靶向治療中也起著不同的作用。因此，抗體類型轉(zhuǎn)換使抗體多樣化，更多地應(yīng)用于抗體的靶向治療[30]。B 細(xì)胞特異性胞苷去氨酶（AID）參與了抗體類別轉(zhuǎn)換的過(guò)程，Ig 基因發(fā)生類別轉(zhuǎn)換最重要的步驟是 DNA 雙鏈的斷裂[31]，斷裂一般是由 B 細(xì)胞特異性酶如重組激活基因蛋白 1/2（RAG 1/2）和 AID 啟動(dòng)。研究者們運(yùn)用 CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯了人類和小鼠的 Ig 基因，利用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的IgM+小鼠 B 細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞及人的 B 細(xì)胞重鏈恒定區(qū)基因高效 DNA 斷裂，故發(fā)生類別轉(zhuǎn)換重組，實(shí)現(xiàn)IgM-IgG-IgA 的抗體類型轉(zhuǎn)換[32]。通過(guò) CRISPR/Cas9 技術(shù)，可靶向編輯雜交瘤細(xì)胞或者 B 細(xì)胞免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的基因，獲得特定類別的抗體，達(dá)到抗腫瘤的目的。

抗體的抗原結(jié)合片段（Fab）分子量小，更易滲透進(jìn)入腫瘤組織，在腫瘤的抗體靶向治療中起著關(guān)鍵作用。因此有研究為了獲得只分泌抗體 Fab 片段的雜交瘤細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)刪除小鼠雜交瘤細(xì)胞的 Fc 段的基因，便可以更為高效簡(jiǎn)便地獲得抗體的 Fab 片段，并易與其他藥物偶聯(lián)進(jìn)而滲透入腫瘤組織，抗腫瘤效果更為顯著。

3 小結(jié)

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯基因的高效性及簡(jiǎn)便性大大地推動(dòng)了臨床醫(yī)療及生物領(lǐng)域的發(fā)展與研究，特別是在抗腫瘤免疫治療中，該基因編輯技術(shù)通過(guò)定向敲除腫瘤免疫檢查點(diǎn)分子或者通過(guò)快速簡(jiǎn)便的基因編輯，推動(dòng)了抗腫瘤免疫治療的研究進(jìn)展，并明顯降低了腫瘤免疫治療的操作難度。然而，由于 CRISPR/Cas9 技術(shù)操作過(guò)程中存在脫靶效應(yīng)以及細(xì)胞內(nèi)遞送效率低的問(wèn)題，其在臨床治療上的應(yīng)用存在限制。

首先是系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，基于 CRISPR/Cas9 的 DNA 單堿基編輯技術(shù)可以降低基因脫靶效應(yīng)，但卻增加了技術(shù)的實(shí)際操作難度[33]。研究表明，Cas9 蛋白的高強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)會(huì)顯著增加 CRISPR/Cas9 的脫靶效應(yīng)發(fā)生率，通過(guò)調(diào)節(jié)光照可以間接調(diào)控 Cas9 的活性，從而抑制其高強(qiáng)度的表達(dá)并減少其非特異性切割，明顯降低脫靶效率。另外，多種病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，也能夠?qū)⒒蚓庉嫊r(shí)的脫靶效率降到最低檢出限以下[34]。其次是 CRISPR/Cas9 操作系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)的遞送效率問(wèn)題。常規(guī)方法不易完成針對(duì)免疫細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，因此常通過(guò)電穿孔的方法將 CRISPR/Cas9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，但是該方法對(duì)細(xì)胞損傷較大，致使細(xì)胞的活力下降，往往達(dá)不到預(yù)期的治療效果。因此，如何在不影響 CRISPR/Cas9 的簡(jiǎn)便性和高效性的同時(shí)又可以有效地降低其脫靶效應(yīng)發(fā)生率，提升其對(duì)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，達(dá)到理想的抗腫瘤免疫治療效果，科學(xué)家們也在積極努力。2015 年，麻省理工學(xué)院的張鋒團(tuán)隊(duì)在 CRISPR/Cas9 技術(shù)的改進(jìn)方面取得了重大進(jìn)展，在來(lái)自細(xì)菌的蛋白酶中，他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠阻止病毒入侵并可以編輯核酸序列的蛋白酶 Cpf1，能夠識(shí)別 T 堿基較多的序列，擴(kuò)大了可編輯的基因范圍[35]。同時(shí)，Cpf1 能夠處理 crRNA 前體，且分子量更小，從而減少了針對(duì)靶向序列 gRNA 的設(shè)計(jì)工作，提高了編輯效率和編輯成功率。2018 年，有科學(xué)家對(duì)spCas9 進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)噬菌體輔助持續(xù)化技術(shù)篩選得出 spCas9 的一個(gè)突變體 xCas9，可以識(shí)別多位點(diǎn)，并且 xCas9 的特異性要高于 spCas9，有效降低了脫靶效率，已被成功地運(yùn)用在基因治療等方面[36]。

綜上，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在抗腫瘤免疫治療中擔(dān)任著重要的治療角色。相信通過(guò)科學(xué)家們的努力，對(duì)此技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的完善，將會(huì)使其更加廣泛地應(yīng)用于基因研究，促進(jìn)抗腫瘤免疫的臨床治療。

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國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD050160202）；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化重大專項(xiàng)（2012ZHXA0419）

王可洲，Email：wangkezhou_cn@163.com

2019-03-13

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.012