朱之烔, 柳 菡*, 寧倩倩, 張 健, 沈偉健,陳惠蘭, 沈崇鈺, 謝 文

(1. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210019; 2. 杭州海關(guān), 浙江 杭州 310016)

苯并咪唑類農(nóng)藥是一類低毒高效內(nèi)吸性的廣譜殺菌劑[1]。其中多菌靈(carbendazim)、甲基托布津(thiophanate-methyl)及乙基托布津(thiophanate-ethyl)較為常見,在水果蔬菜及農(nóng)副產(chǎn)品中檢出率較高[2,3]。其中多菌靈的急性毒性比較低,但它在自然界中降解半衰期長,可通過食物鏈蓄積對人類身體健康尤其是生殖系統(tǒng)造成危害[4]。而甲基托布津不穩(wěn)定,會在植物體內(nèi)中轉(zhuǎn)化為多菌靈[5]。洛苯達唑(lobendazole,即ethylN-(1H-benzimidazol-2-yl)carbamate,簡稱EBC)是乙基托布津在生物體內(nèi)的代謝物[5]。研究表明,其小鼠靜脈注射半數(shù)致死量(lethal median dose, LD50)為180 mg/kg,具有一定的生殖毒性,能夠影響胎兒的肌肉骨骼發(fā)育,具有一定的致畸性[6]。

新煙堿類農(nóng)藥是一類昆蟲乙酰膽堿受體激動劑,能引發(fā)劇烈的神經(jīng)毒害效應(yīng)[1]。其中常見的有吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲嗪等。雖然對哺乳動物無毒害作用,但新煙堿類殺蟲劑會對蜜蜂免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等造成損傷,甚至引起蜜蜂急性中毒死亡[7],不僅僅使養(yǎng)蜂業(yè)承受了巨大的經(jīng)濟損失,更會危害整個生態(tài)系統(tǒng)。

蜂蜜是一種營養(yǎng)豐富的純天然滋養(yǎng)食品。但由于蜜蜂在采蜜過程中采集了被農(nóng)藥污染的花粉及蜂農(nóng)不恰當(dāng)使用的農(nóng)藥,導(dǎo)致蜂蜜中的農(nóng)藥殘留量有可能超標(biāo)。研究表明,全球超過75%的蜂蜜含有至少一種農(nóng)藥的殘留[8]。目前,歐盟規(guī)定蜂蜜中多菌靈和苯菌靈總和不超過1.0 mg/kg[9],并自2013年以來限用并將全面禁用3種新煙堿類殺蟲劑(吡蟲啉、噻蟲胺和噻蟲嗪)[10]。而我國暫未規(guī)定蜂蜜中這兩類農(nóng)藥的殘留限量。

目前國內(nèi)分別檢測苯并咪唑類和新煙堿類農(nóng)藥殘留的文獻有很多,包括了紫外可見分光光度法[11]、免疫化學(xué)法[12,13]、高效液相色譜法[14,15]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16,17]和離子交換色譜法[18]等方法。其中,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法抗干擾能力強,靈敏度高,是主要的分析方法。但針對蜂蜜基質(zhì)的研究不多,且同時涉及兩類農(nóng)藥的較少,對洛苯達唑的研究報道極少。蜂蜜中含有大量的糖類物質(zhì)和少量的有機雜質(zhì),蜂蜜中農(nóng)藥殘留的前處理方法有液液萃取法[16]、分散固相萃取法[17]和固相萃取法[19]等。由于基質(zhì)效應(yīng)的存在,報道的研究大多使用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線。本研究針對4種苯并咪唑類農(nóng)藥(多菌靈、甲基托布津、乙基托布津、洛苯達唑)和5種新煙堿類農(nóng)藥(吡蟲啉、啶蟲脒、呋蟲胺、烯啶酰胺和氟啶蟲酰胺),采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,在此基礎(chǔ)上比較了不同的溶解試劑和前處理凈化方式,建立了蜂蜜中9種苯并咪唑類和新煙堿類農(nóng)藥殘留的全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀和Agilent 6470A三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);真空氮氣吹干儀(美國Caliper公司); Heraeus Mutifuge X1R離心機(美國Thermo-Fisher公司); Smart-N超純水機(美國Millipore公司);親水親脂平衡(hydrophilic-lipophilic balance, HLB)固相萃取柱(美國WATERS公司); Preval SPE 304+全自動固相萃取裝置(北京普立泰科儀器公司)。

多菌靈、甲基托布津、乙基托布津、吡蟲啉、啶蟲脒、呋蟲胺、烯啶蟲胺和氟啶蟲酰胺,純度均高于97%(德國Dr. Ehrenstorfer公司);洛苯達唑,純度高于99%(北京曼哈格生物科技有限公司);多菌靈-D4、吡蟲啉-D4,純度均高于97%(美國Sigma-Aldrich公司);甲醇、甲酸、乙腈、乙酸乙酯,均為色譜純(德國Merck公司);水合磷酸二氫鉀,分析純(南京化學(xué)試劑有限公司);N-丙基乙二胺(PSA), 40～60 μm(美國Sepax Technologies公司);實驗用蜂蜜樣品均購自超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取9種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg,分別用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(多菌靈和洛苯達唑可以加入適量甲酸助溶),放置在-18 ℃的冰箱中冷凍保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別取適量上述9種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇逐級稀釋,配制成1 mg/L和0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,放置在-4 ℃的冰箱中保存。

內(nèi)標(biāo)儲備液:準(zhǔn)確稱取10.0 mg的多菌靈-D4、吡蟲啉-D4,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液,放置在-18 ℃的冰箱中冷凍保存。

內(nèi)標(biāo)工作溶液:取適量內(nèi)標(biāo)儲備液,用甲醇稀釋,配制成0.1 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液,放置在-4 ℃的冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制:準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)工作液100 μL、標(biāo)準(zhǔn)工作液適量,以甲醇-水溶液(3∶7, v/v)配制質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 mg/L的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

磷酸鹽緩沖液的配制:準(zhǔn)確稱量27.2 g水合磷酸二氫鉀固體,先用800 mL水溶解,再用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.8,加水至1 000 mL。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

準(zhǔn)確稱量提前混勻的蜂蜜樣品(1.00±0.05) g,置于50 mL塑料離心管中,加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液、15 mL磷酸鹽緩沖溶液,加蓋渦旋使溶液充分溶解、混勻;超聲15 min;用濾紙過濾至20 mL玻璃試管中,待凈化。

1.3.2凈化

先將上述玻璃試管放入全自動固相萃取儀中,再將HLB固相萃取柱放入全自動固相萃取儀中,預(yù)先設(shè)計好程序(HLB固相萃取柱用5 mL甲醇活化,5 mL水平衡,采用3 mL/min的流速上樣,5 mL水淋洗,5 mL甲醇洗脫),樣品按此程序進行凈化;洗脫液在45 ℃水浴下氮氣吹干;用甲醇-水溶液(3∶7, v/v)定容至1.0 mL,渦旋30 s,過0.22 μm濾膜至進樣小瓶中,供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:SVEA C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;流動相A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 95%A; 1～2 min, 95%A～40%A; 2～5 min, 40%A～0%A; 5～6 min, 0%A～95%A。進樣量:10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;噴霧電壓:4 000 V;干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:10 L/min;霧化氣壓力:344 kPa;鞘氣溫度:400 ℃;鞘氣流速:12 L/min; 11種化合物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 11種化合物的監(jiān)測離子對、毛細管出口電壓、碰撞能量、保留時間及內(nèi)標(biāo)物Table 1 Monitoring ion pairs, fragmentor, collision energy, retention time and internal standards of the 11 compounds

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

蜂蜜中含有大量的糖類物質(zhì)和少量的有機雜質(zhì),本實驗著重于前處理方法的研究。在50.0 μg/kg水平下,各前處理方法分別做3個平行的陰性樣品加標(biāo)試驗,以平均回收率判定方法的優(yōu)劣。

圖 1 不同溶劑對乙酸乙酯提取后的目標(biāo)化合物回收率的影響Fig. 1 Effect of the different dissolving reagents on the recoveries of the target compounds after extraction with ethyl acetate

2.1.1樣品溶解試劑的確定

由于蜂蜜基質(zhì)的特殊性,直接加入有機試劑時樣品易變成膠質(zhì)狀,故先用少量水溶解、稀釋蜂蜜,使其成為均相體系。研究最初采用液液萃取法進行預(yù)處理,而乙酸乙酯是常用的提取試劑,且據(jù)報道[16]對多菌靈等農(nóng)藥有較高的回收率。故在樣品內(nèi)加入乙酸乙酯,渦旋、超聲、離心后,將提取液氮吹濃縮至干,復(fù)溶后進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。實驗結(jié)果如圖1所示,僅有多菌靈、洛苯達唑、吡蟲啉和啶蟲脒的回收率達到80%,呋蟲胺約40%,而甲基托布津、乙基托布津、烯啶蟲胺和氟啶蟲酰胺的回收率不足25%。

蜂蜜溶于水后的溶液偏酸性,而且研究中的農(nóng)藥呈中性至弱堿性,可能會以離子形式存在于蜂蜜水溶液中,不利于有機溶劑提取。因此,考慮使用偏堿性的磷酸鹽緩沖液(pH=7.8)來溶解和稀釋蜂蜜,使目標(biāo)物在此pH值下以分子形式存在,再加入乙酸乙酯超聲提取,提取液濃縮定容后,進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析,結(jié)果如圖1所示。在緩沖液溶解樣品后,呋蟲胺的回收率提高明顯,達到了70%以上。甲基托布津、乙基托布津、烯啶蟲酰胺和氟啶蟲酰胺也均有一定提高,但仍不足50%。多菌靈、洛苯達唑、吡蟲啉和啶蟲脒也均有較好的回收率。故選用磷酸鹽緩沖液作為蜂蜜樣品的溶解試劑。

2.1.2樣品前處理方法的選擇

研究比較了乙酸乙酯萃取法、QuEChERS法和固相萃取法的凈化效果。QuEChERS法是以乙腈作提取溶劑,加入適量的鹽,以鹽析作用促進提取,分散固相萃取法凈化來完成[20]。將樣品用少量緩沖液溶解后,加入適量乙腈超聲提取?？紤]到PSA可以吸附基質(zhì)中各種極性有機酸、糖類和脂肪等雜質(zhì),故在鹽析過程中加入少量PSA除雜。

固相萃取技術(shù)能夠選擇性吸附、保留目標(biāo)物,除去雜質(zhì)的同時,還能起到濃縮的作用。其中的HLB固相萃取柱常用于凈化蜂蜜中大量糖類及極性極強的雜質(zhì)[19]。蜂蜜樣品經(jīng)緩沖液溶解后,需過濾以避免固相萃取柱堵塞。過濾液經(jīng)固相萃取柱凈化后,收集的洗脫液經(jīng)氮吹復(fù)溶后進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

由圖2可知,對于多菌靈、洛苯達唑和吡蟲啉,3種方法均有較好的回收率;對于啶蟲脒、呋蟲胺,乙酸乙酯萃取法和固相萃取法的回收率可達75%以上;對于烯啶蟲胺、氟啶蟲酰胺,QuEChERS法和固相萃取法的回收率達到75%以上;對于甲基托布津和乙基托布津,僅有固相萃取法的回收率較好。故選擇HLB固相萃取法對樣品進行凈化。

圖 2 不同前處理方法對目標(biāo)化合物回收率的影響Fig. 2 Effect of different pretreatment methods on the recoveries of the target compounds Method 1: extraction by ethyl acetate; method 2: extraction by QuEChERS; method 3: extraction by solid-phase extraction with hydrophilic-lipophilic balance (HLB) cartridges.

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

實驗之初以水溶液作為水相,發(fā)現(xiàn)甲基托布津和乙基托布津的峰形拖尾嚴(yán)重,其他化合物的峰形也存在一定程度的不對稱。而以0.1%(v/v)甲酸作水相時,各化合物的峰形對稱,如圖3所示。因此采用0.1%(v/v)甲酸溶液作水相,0.1%(v/v)甲酸甲醇為有機相。

2.2.2質(zhì)譜條件的確定

研究的9種農(nóng)藥以及同位素內(nèi)標(biāo)的分子結(jié)構(gòu)均含有氨基,易形成正離子,故采用正離子模式進行電離。在MRM模式下對11種化合物的母離子、毛細管出口電壓,子離子、碰撞能量等條件進行優(yōu)化,結(jié)果如表1所示。由于流動相中添加少量甲酸,11種化合物的母離子峰均為加氫峰。

圖 3 0.05 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中11種化合物的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of the 11 compounds in 0.05 mg/L standard solution

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

確定實驗方法后,按照1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進行標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定。以質(zhì)量濃度(X, mg/L)為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,在0.002～0.05 mg/L范圍內(nèi),9種農(nóng)藥均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r2≥0.99),如表2所示。在陰性蜂蜜中加標(biāo)測定,3倍信噪比對應(yīng)的加標(biāo)水平為方法的檢出限,10倍為定量限,結(jié)果如表2所示。

2.3.2回收率和精密度

選取陰性蜂蜜樣品,分別在5.0、10.0、20.0 μg/kg 3個水平下進行加標(biāo)試驗,測得的回收率和精密度如表3所示。結(jié)果顯示,蜂蜜中9種農(nóng)藥的平均回收率在78.2%～104.6%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～14.3%之間。

表 2 9種農(nóng)藥的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the nine pesticides

Y: peak area ratio of the quantitative ion of pesticide to internal standard;X: mass concentration, mg/L.

表 3 陰性蜂蜜中9種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the nine pesticides in blank honey (n=6)

2.4 實際樣品檢測

用上述建立的方法對實際蜂蜜樣品進行檢測。選擇30批蜂蜜樣品進行檢測,多菌靈、吡蟲啉和啶蟲脒分別有不同程度的檢出。其中多菌靈檢出17批,殘留量在5～10 μg/kg之間。吡蟲啉和啶蟲脒分別檢出13批和12批,檢出量分別為5～20 μg/kg和5～10 μg/kg。其余農(nóng)藥未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了蜂蜜樣品經(jīng)緩沖液溶解、稀釋、提取,通過HLB固相萃取柱凈化,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析的檢測方法。此方法前處理簡單、快速,操作簡便易行,且準(zhǔn)確,靈敏度高,重現(xiàn)性好,檢出限低,能夠滿足大批量蜂蜜樣品中9種苯并咪唑類、新煙堿類農(nóng)藥同時檢測的要求。