賈麗娟，杜蘇豐

西安市胸科醫(yī)院呼吸科(西安 710100)

隨著社會的發(fā)展，腫瘤的發(fā)病率逐年增長，呈上升趨勢，在當今的21世紀，嚴重的威脅著人類的身體健康，降低了人類的生活質(zhì)量,盡管積極采用化療、放療及手術等方式治療，但肺癌患者的5年生存率依然不高。自20世紀60年代初次記錄新城疫病毒(Newcastle disease vires，NDV)可以在腫瘤細胞中復制并對腫瘤細胞具有殺傷作用以來，學者們總是在嘗試將NDV應用于惡性腫瘤的治療[1]。大量的臨床實驗研究顯示，NDV是安全、有效的。NDV在腫瘤治療中是具有廣泛應用前景的，目前國內(nèi)外NDV用于肺癌治療的研究甚少。本研究擬運用穩(wěn)定表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒疫苗(Recombinant avirulent NDV La Sota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rl-RVG) 對人肺腺癌A549荷瘤鼠進行研究,探討其對肺腺癌生長的發(fā)展及可能機制。

材料與方法

1 材 料 rl-RVG與NDV由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室惠贈；實驗小鼠購自揚州大學；人肺腺癌A549細胞為本室保存；DMEM及胎牛血清購自維森特公司；小鼠抗狂犬病毒ERA株G蛋白一抗購自美國Santa Cruz公司，雞抗LaSota株NDV一抗由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室惠贈，山羊抗鼠二抗購自北京康維世紀有限公司，兔抗雞二抗購自Earthox公司，小鼠淋巴細胞分離液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Anti-mouse CD3e PE購自美國 eBioscince 公司；FITC anti-mouse CD49b購自美國biolegend 公司。

2 研究方法

2.1 A549荷瘤鼠的建立：取30只4周齡裸鼠，體質(zhì)量18～22 g。人肺腺癌A549細胞復蘇后移入含有10 %胎牛血清和雙抗的DMEM 中，37℃，5%CO2培養(yǎng)。待細胞生長至指數(shù)期，胰酶消化后收集，PBS配制成5×108/ ml濃度。每只小鼠腋下皮下注射0.3 ml A549懸液，經(jīng)10 d左右，每只小鼠皮下均長成直徑為5～20 mm的瘤體。

2.2 實驗分組：將成瘤的裸鼠平均分為三組，每組10只，隨機分為rl-RVG組(實驗組)，NDV組(實驗組)及對照組，分別于瘤體注射rl-RVG 6.3×108pfu，NDV 6×107pfu，PBS液300 μl。每周2次，持續(xù)3周。自第一次注射日(0 d)開始，每7 d測量小鼠腫瘤體積。第21 d時小鼠全部處死，鈍性剝離瘤體，并取肺及脾等，一部分用4%低聚甲醛固定，另一部分于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 腫瘤生長曲線及抑瘤率：自第1次注射日(0d)開始，每7d分別用游標卡尺測量瘤體短徑(a)及長經(jīng)(b)(包括皮膚厚度在內(nèi))，計算瘤體體積(V)：V=a2×b×0.52，并繪制腫瘤生長曲線。根據(jù)末次腫瘤體積計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均腫瘤體積-實驗組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%。

2.4 RT-PCR檢測RVG及NDV HN基因表達：取小鼠新鮮皮下瘤體，TRIZOL法提取瘤體組織總RNA，以Oligo dT為反轉(zhuǎn)錄引物用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，引物分別為：RVG：上游5'-AGCCGATGCACTACAAG-3'，下游5' -CTGGAGGAGGGATGATTGC-3'，擴增長度：175 bp；NDV HN：上游5'-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3'，下游5'- TAATGCGACTGCGGGATGTG- 3'，擴增長度：462 bp，進行PCR，PCR的循環(huán)條件：94 ℃ 熱啟動預變性5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s(NDV HN為55 ℃ 30 s)，72 ℃ 30 s ,共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，對擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖電泳分析。

2.5 蛋白印跡法檢測皮下瘤體組織RVG、NDV蛋白表達：取小鼠新鮮皮下瘤體組織，提取組織蛋白后，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后分別使用鼠抗G蛋白一抗，雞抗NDV一抗，稀釋比為1∶500，按1∶10 000分別稀釋山羊抗鼠IgG抗體，兔抗雞IgG抗體為二抗,行蛋白質(zhì)印跡檢測.

2.6 流式細胞術檢測rl-RVG轉(zhuǎn)染后脾NK細胞(CD3+CD49b+)數(shù) ： 取脾臟研磨成脾細胞懸液，用0.83%TrisNH4Cl破壞紅細胞，PBS(pH=7.4)洗滌3次，染色緩沖液調(diào)整細胞濃度為1×106/ml備用。取試管加入100 μl脾細胞懸液，0.5 μl CD49bFITC，2.5 μl CD3+PE，振蕩混勻，避光孵育30 min。加PBS 1.5 ml洗1次，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清，加300 μlPBS振蕩重懸細胞，上流式細胞儀檢測。每組均設同種型對照，Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)，Win MDI 2. 9軟件分析數(shù)據(jù)。

結 果

1 A549荷瘤鼠模型的建立 將收集到的A549細胞懸液注入小鼠腋下皮下，經(jīng)10 d左右，每只小鼠皮下均長成直徑為5～20 mm的瘤體(圖1)。

圖1 A549細胞荷瘤裸鼠

2 腫瘤生長曲線 21 d后，rl-RVG組，NDV組和對照組三組腫瘤體積分別為(804.96±176.74)mm3，(1127.88±274.09)mm3，(1960.92±446.758)mm3(F=26.044，P<0.01)。rl-RVG組和NDV組腫瘤體積明顯小于對照組,表明其腫瘤生長緩慢，且rl-RVG組瘤體生長較NDV組慢(圖2、圖3)，見表1。

3 RT-PCR檢測RVG及NDV HN基因表達 取小鼠的皮下瘤體組織，行RT-PCR檢測瘤體組織RVG及NDV HN基因的表達，結果顯示三組均可在496 bp 出現(xiàn)GAPDH基因條帶；rl-RVG組及NDV組在462 bp出現(xiàn)NDV HN基因條帶，PBS組無條帶(A)；rl-RVG組在175 bp出現(xiàn)RVG基因條帶，NDV組及PBS組均無條帶(B)(圖4)。

4 Western blot檢測皮下瘤體組織RVG及NDV蛋白表達 取小鼠的皮下瘤體組織行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測瘤體組織RVG及NDV 的蛋白表達，Western blot結果表明：rl-RVG組有RVG的蛋白條帶，NDV組及PBS組無RVG的蛋白條帶；rl-RVG組及NDV組有NDV的蛋白條帶，PBS組無NDV的蛋白條帶(圖5)。

圖2 三周時各組荷瘤裸鼠瘤體體積

組 別1 d7 d14 d21 drl-RVG組274.67±114.2444.18±111.22657.56±176.74804.96±176.74*NDV組274.08±127.05453.65±164.94958.26±274.091127.88±274.09**PBS組271.78±110.79591.45±244.51483.21±446.751960.92±446.758F值0.0010.8467.75226.044P值0.9990.4580.0090.000

注：rl-RVG組與NDV組及PBS組比較 *P<0.05；NDV組與PBS組比較 **P<0.05

圖3 三組瘤體生長曲線

注：1：rl-RVG組GAPDH；2：NDV組GAPDH；3：PBS組GAPDH；4：rl-RVG組；5：NDV組；6：PBS組 M：DL 1 000 DNA Marker；

圖4 rl-RVG 感染后組織RVG及NDV HN基因的表達

圖5 rl-RVG感染小鼠后瘤體組織RVG及NDV蛋白表達

5 流式細胞術檢測rl-RVG轉(zhuǎn)染后脾NK細胞數(shù) 結果顯示，rl-RVG組、NDV組和對照組三組NK(CD3+CD49b+)細胞數(shù)分別為(43.2±5.26)%，(28.8±2.38)%，(18.8±5.9)%(F=31.58，P<0.01)；其中，rl-RVG組和NDV組明顯高于對照組(t分別為6.147，3.751，P均<0.05)，且rl-RVG組明顯高于NDV組(t=7.203，P<0.05，見圖6)。

討 論

溶瘤治療是一種集基因治療、免疫治療于一體的新的生物治療方法，作為一種新的癌癥治療方法，具有一定的潛力。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種病毒具有溶瘤作用，其中新城疫病毒(NDV) 已經(jīng)在臨床諸多腫瘤中得到廣泛應用，并取得了一定的療效，如乳腺癌[2]、直腸癌[3]等。NDV還可作為免疫療法運用于神經(jīng)母細胞瘤[4]，黑色素瘤[5]及其他惡性腫瘤，但關于其對肺癌的研究尚少。

圖6 rl-RVG感染后脾NK細胞比例

NDV是無需基因改造的天然的溶瘤病毒，由于其在正常細胞中會引起很強的抗病毒反應，導致短時間內(nèi)即會被清除，而對腫瘤細胞則能夠選擇性地感染并在腫瘤細胞中高效復制。復制過程中釋放病毒粒子進而感染鄰近細胞，鄰近細胞相互融合形成細胞合胞體[6]。

NDV對腫瘤的殺傷機制尚不明確，目前多從以下幾個方面進行闡述：①NDV對腫瘤細胞能夠進行直接并且特異性地殺傷作用；②NDV能夠激活宿主細胞及體液免疫應答[7]；③NDV能夠刺激機體產(chǎn)生多種細胞因子，增強機體的免疫應答能力[8]。激活的NK細胞可以產(chǎn)生一些細胞因子：如IL- 2、 IFN- γ及TNF-α等，更進一步影響和激活其他免疫細胞的功能，對于腫瘤細胞更具有溶細胞作用[9]。葛金英等[6]成功構建可以建穩(wěn)定表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒(rL-RVG),穩(wěn)定表達的狂犬病毒糖蛋白(RVG)，能夠增加NDV在細胞之間的擴散且不會增加NDV對禽類和老鼠的毒性及調(diào)節(jié)受體的結合滲透與結合[10]，使得rl-RVG更有效的作用于腫瘤細胞。

本實驗結果顯示：RVG及NDV在A549荷瘤鼠皮下瘤中的基因及蛋白表達，說明rl-RVG及NDV成功感染至A549荷瘤鼠內(nèi)。rl-RVG組及NDV組的腫瘤體積生長速度明顯慢于對照組，且腫瘤體積明顯小于對照組，說明rl-RVG及NDV對肺腺癌有著明顯的抑制作用，且rl-RVG的作用較NDV更加顯著。本實驗結果說明：rl-RVG及NDV激活了機體的免疫反應， 使NK細胞明顯增生，增加機體對腫瘤細胞的殺傷作用，rl-RVG的作用較NDV更加明顯。

綜上所述，本實驗說明重組新城疫病毒rl-RVG對A549荷瘤鼠腫瘤生長有著明顯的抑制作用，其可能與rl-RVG自身溶瘤作用及其導致的免疫系統(tǒng)的激活有著密切的關系，為rl-RVG對肺癌的研究指明了方向。