朱 婧，郭建麗

1.陜西省人民醫(yī)院麻醉科(西安710068);2.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中心醫(yī)院麻醉科(鄂爾多斯 017000)

急性心肌梗死是嚴重威脅人類健康及導(dǎo)致人類死亡的心血管疾病。介入、溶栓及搭橋術(shù)是目前臨床常用的治療急性心肌梗死的手段，可及時恢復(fù)病變區(qū)血流再灌注，挽救瀕死心肌細胞；然而缺血區(qū)血流再灌注有時會加速心肌死亡，擴大梗死區(qū)面積，引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。以往諸多研究顯示，MIRI不僅局限于局部組織，且會對遠隔器官組織造成影響，從而影響患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸[1-3]。因此，如何預(yù)防MIRI及其對遠隔器官組織的影響成為目前國內(nèi)外研究熱點。報道顯示，可通過抑制心肌缺血再灌注損傷機體心肌細胞凋亡及機體氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑，保護心肌細胞。近年來，多項研究顯示，麻醉藥物、尤其是吸入性麻醉藥物預(yù)處理MIRI具有很好的保護作用。氙氣是麻醉效果良好的理想型吸入惰性氣體。大量研究證實，氙氣預(yù)處理具有很好神經(jīng)及心臟保護作用[4-5]。因此研究擬通過觀察氙氣預(yù)處理對MIRI大鼠心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討氙氣對MIRI大鼠心肌細胞的保護作用及機制。

材料和方法

1 實驗材料 己糖激酶(K-H)液、0.5倍肺泡最小有效濃度(Minimum alveolar concentration，MAC)氙氣飽和K-H液，即40%氙氣+35%氮氣+25%混合氣體飽和K-H液、1 MAC即75% 氙氣+25%氧氣混合氣。成年雄性SD大鼠64只，體重265～350 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。采用隨機抽簽方式將其均分為四組，每組16只：假手術(shù)組(S組)、MIRI組(模型組)、0.5 MAC疝氣預(yù)處理+心肌I/R組(0.5 XR組)和1 MAC疝氣預(yù)處理+心肌I/R組(1 XR組)。

2 動物處理

2.1 MIRI模型制備：SD大鼠采用腹腔注射劑量為50 mg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉，待麻醉成功后將其固定于手術(shù)臺上，剪毛消毒后切開大鼠右頸，分離總動脈備用；切開暴露氣管組織，內(nèi)置氣管套管，隨后連接動物呼吸機進行正壓通氣通氣(呼吸頻率約60～70次/min)，于其四肢皮下接通電極，與BL-420S型生物機能系統(tǒng)進行連接以持續(xù)記錄大鼠心電圖。在大鼠胸骨左緣部位做縱向切口，并在第5肋間開胸，打開大鼠心包，充分暴露心臟；之后采用6-0號無損傷縫合線在左耳下緣2 mm處穿過左冠狀動脈前降支，使心肌缺血30 min，松開結(jié)扎線后再灌注120 min。MIRI模型制備成功的標注為：缺血時局部心肌組織呈蒼白、發(fā)紺狀，心電圖監(jiān)測顯示ST段明顯抬高或出現(xiàn)T波高聳；缺血區(qū)在出現(xiàn)血流再灌注后心肌組織轉(zhuǎn)紅，心電圖監(jiān)測中所出現(xiàn)的明顯抬高的ST段下降50%以上。

2.2 實驗處理：S組大鼠開胸后至穿線不進行左冠狀動脈前降支的結(jié)扎，持續(xù)150 min；模型組則在結(jié)扎左冠狀動脈前降支使心臟缺血30 min后，松開結(jié)扎線使血流再灌注120 min；0.5 XR組采用0.5 MAC氙氣預(yù)處理60 min，分4個循環(huán)，每個循環(huán)用含有0.5 MAC氙氣的K-H液灌注5 min，然后再用純K-H液進行10 min的洗脫，4個循環(huán)結(jié)束后進行左冠狀動脈前降支的結(jié)扎缺血處理30 min，復(fù)灌注120 min；1 XR組則使用1 MAC氙氣的K-H液進行預(yù)處理，預(yù)處理過程同0.5 XR組。

3 觀察指標

3.1 心肌梗死面積評估：再灌注結(jié)束，每組取4只大鼠阻斷左冠狀動脈前降支，通過頸內(nèi)靜脈注射伊文斯藍，心肌正常區(qū)發(fā)生藍染，快速取出心臟并分離出左心室，并將心室橫斷成2 mm厚的組織塊；同時分離出正常的藍染組織。將未發(fā)生染色的危險區(qū)組織置于0.5%TPT中，并于37℃條件下水浴處理15 min，10%福爾馬林進行24 h固定。梗死區(qū)則發(fā)生染色呈現(xiàn)灰白色，于顯微鏡下對其進行切割稱重。心肌梗死范圍=梗死區(qū)心肌質(zhì)量/危險區(qū)心肌質(zhì)量×100%

3.2 心肌細胞凋亡：再灌注結(jié)束，每組取4只大鼠處死，快速切除心臟并分離出左心室。使用細胞凋亡測定試劑盒測定心室內(nèi)凋亡心肌細胞數(shù)量，細胞核為藍色的屬于正常細胞，棕黃色為凋亡陽性細胞。標本切片于400倍鏡下隨機取5個視野進行細胞計數(shù)。心肌細胞凋亡指數(shù)為凋亡細胞總數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

3.3 血清生化指標：再灌注120 min后取4只大鼠，經(jīng)腹部取其主動脈血樣5 ml， 3000 r/min條件下，4℃冷凍離心15 min，獲得血清-20℃保存用于測定血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、一氧化氮合酶(eNOS)活性。CK、CK-MB、eNOS測定均選擇免疫熒光法，其中CK、CK-MB試劑盒基蛋生物科技股份有限公司，eNOS試劑盒購自于南京信帆生物技術(shù)有限公司。

3.4 氧化應(yīng)激指標：再灌注結(jié)束，每組4枚心臟中取其左室固定部位心肌組織0.5 cm×0.5 cm×1 cm，做勻漿處理，取10%的勻漿液置于4℃低溫離心機中進行離心，2000 r/min條件下離心8 min。采用黃嘌呤氧化酶法測定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，選擇硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)采用雙抗體夾心法測定。所用試劑盒均購自于上海紀寧實業(yè)有限公司。

結(jié) 果

1 四組大鼠再灌注120 min后心肌梗死范圍和細胞凋亡指數(shù)對比 見表1。與S組相比，模型組心肌梗死范圍明顯增大，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌梗死范圍顯著縮小，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌梗死范圍和心肌細胞凋亡指數(shù)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 四組大鼠再灌注120min后心肌 梗死范圍和細胞凋亡指數(shù)對比(%)

注：與對照組比， *P<0.01；與模型組比，#P<0.05

2 四組大鼠心肌組織中SOD、MDA、GSH-PX含量對比 見表2。與S組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-PX含量顯著減少，MDA含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠SOD、GSH-PX含量顯著增加，MDA含量顯著下降(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠心肌組織中SOD、MDA、GSH-PX含量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 四組大鼠心肌組織中 SOD、MDA、GSH-PX含量比較

注：與對照組比，*P<0.01；與模型組比，#P<0.05

3 四組大鼠再灌注120 min后血清CK、CK-MB、eNOS活性對比 見表3。與S組相比，模型組大鼠血清CK、CK-MB活性顯著增強，eNOS活性顯著下降(P<0.01)；與模型組比，0.5 XR組和1 XR組大鼠CK、CK-MB活性顯著降低，eNOS活性顯著增強(P<0.05)。但0.5 XR組和1 XR組大鼠血清CK、CK-MB、eNOS活性間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 四組大鼠再灌注120min后血清 CK、CK-MB、eNOS活性對比

注：與對照組比， *P<0.01；與模型組比，#P<0.05

討 論

MIRI是一個涉及細胞凋亡、氧化自由基產(chǎn)生、諸多炎癥介質(zhì)和免疫因子釋放等過程的復(fù)雜性病理反應(yīng)。缺血再灌注后抗氧化物質(zhì)大量消耗，氧自由基等毒性產(chǎn)物大量積累，破壞心肌細胞結(jié)構(gòu)，激活機體炎癥反應(yīng)，造成心肌進一步損傷，最終導(dǎo)致心肌細胞凋亡加速，梗死范圍擴大。預(yù)先對臟器做短暫的缺血再灌注處理后，通過調(diào)節(jié)機體炎癥介質(zhì)釋放，激活神經(jīng)傳導(dǎo)通路等，可提高器官組織的抗MIRI能力，此方法即為缺血預(yù)處理。目前，缺血預(yù)處理被認為是臨床中有效的內(nèi)源性保護機制。許多實驗證實，揮發(fā)性麻醉藥物預(yù)處理具有一定器官組織保護作用。

氙氣臨床特性接近理想型吸入麻醉藥物，其血氣分配系數(shù)較低，因此對心血管系統(tǒng)的抑制作用相對較小。賈平等研究顯示，不同時相氙氣預(yù)處理均可降低腎臟缺血再灌注損傷[6]。眾所周知，miRNA參與多種器官IRI的發(fā)展和缺血預(yù)處理的保護作用。Jia通過miR-21體內(nèi)敲除和miR-21靶通路分析來確定氙氣預(yù)處理對于腎臟IRI的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氙氣預(yù)處理2 h可對腎臟IRI提供形態(tài)學(xué)和功能性保護作用[7]；Li等研究表明，75%氙氣預(yù)處理可可通過阻斷IRI引起的線粒體結(jié)構(gòu)改變，開放mitoKATP通道，從而顯著改善兔模型心功能，縮小其心肌梗死面積，減少細胞凋亡，抑制CK-MB釋放[8]；Liu等發(fā)現(xiàn)，氙氣處理通過激活A(yù)KT和ERK信號通路，減輕大鼠脊髓IRI程度[9]。IRI會導(dǎo)致心肌組織細胞中SOD、GSH-PX等自由基清除酶含量下降，導(dǎo)致機體氧自由基大量堆積；進一步脂質(zhì)過氧化反應(yīng)導(dǎo)致機體MDA含量增加；eNOS為調(diào)節(jié)NO合成的限速酶，NO具有擴張血管、抑制炎癥細胞功能，改善冠脈血液供應(yīng)的內(nèi)源性信號分子，具有很好的保護心肌內(nèi)皮細胞的功效[10]。同時，心肌缺血還會對細胞膜造成損傷，使得通透性增加，從而導(dǎo)致CK、CK-MB釋放至血液，因此血清中CK、CK-MB含量也是反應(yīng)心肌細胞損傷程度的良好指標。本研究選擇阻斷左冠狀動脈前降支的方式造成大鼠缺血30 min，之后恢復(fù)灌注120min獲得MIRI模型。研究結(jié)果顯示，與S組比，模型組心肌梗死范圍顯著增加，心肌細胞凋亡指數(shù)明顯升高，心肌組織中SOD、GSH-PX和血清eNOS活性顯著下降，MDA含量顯著增加，血清CK、CK-MB活性顯著增強，提示MIRI模型制備成功。筆者在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，參照文獻選擇0.5 MAC氙氣和1MAC氙氣進行預(yù)處理。結(jié)果提示氙氣可通過抑制大鼠MIRI后氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌組織進一步損傷。但0.5 XR組和1 XR組大鼠各指標間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，氙氣預(yù)處理可通過抑制大鼠機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌細胞凋亡數(shù)目及心肌梗死面積，降低CK及CK-MB釋放，從而達到保護心肌細胞的預(yù)處理功效。但加大氙氣使用百分比后對心肌細胞保護作用有限。