任賀田，方 寧，陳代雄

(1.遵義醫(yī)科大學 研究生院，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 貴州省細胞工程重點實驗室， 貴州 遵義 563099)

人羊膜上皮組織形成于受精后的第8天，人羊膜上皮細胞(Human amniotic epithelial cells,hAECs)由胚胎上胚層衍化而來。在胚胎階段，hAECs的功能與神經(jīng)分化、母胎-免疫耐受及胎兒發(fā)育穩(wěn)態(tài)環(huán)境有關。從足月分娩的胎盤羊膜提取的hAECs不僅具有多向分化潛能，而且具有免疫調節(jié)作用和獨特的神經(jīng)生物學特性，這些特性有助于病損組織和器官的再生和修復[1]。近年來，hAECs的神經(jīng)生物學特性備受關注，其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面具有重要的研究和應用價值。

1 hAECs的神經(jīng)生物學特性

hAECs具有向神經(jīng)細胞分化潛能、合成及釋放神經(jīng)遞質和神經(jīng)營養(yǎng)作用，這些神經(jīng)生物學特性是其修復病損神經(jīng)組織的重要生物學基礎。

1.1 向神經(jīng)細胞分化潛能 hAECs表達SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4、Nanog等干細胞標志，具有多向分化潛能[2-3]。hAECs可分化為神經(jīng)細胞并表達與神經(jīng)細胞相關的多種標志物。Sakuragawa等[4]報道培養(yǎng)的hAECs中有超過50%的細胞表達神經(jīng)元標志物如RC1、A2B5、波形蛋白、神經(jīng)絲蛋白( NFP)、微管相關蛋白2(MAP2)和MAP2激酶，有20%表達神經(jīng)膠質細胞標志如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶、髓鞘堿性蛋白(MBP)和半乳糖腦苷脂。有研究證實，體外培養(yǎng)和誘導的hAECs可以不同比例分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[5-7]。

1.2 合成及釋放神經(jīng)遞質 兒茶酚胺(Catecholamines,CA) 包括多巴胺(Dopamine,DA)、去甲腎上腺素和腎上腺素，它們都是重要的中樞神經(jīng)遞質，許多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病與多巴胺能神經(jīng)通路障礙有關。Elwan等[8]通過體外實驗證明，hAECs可自發(fā)地分泌CA，在培養(yǎng)基中添加 CA前體物1-酪氨酸和酪氨酸羥化酶輔助因子四氫生物喋呤后，hAECs合成CA明顯增加，而通過添加α-甲基-p-酪氨酸抑制酪氨酸羥化酶(TH)的作用則可明顯降低CA的產(chǎn)生；進一步檢測發(fā)現(xiàn)hAECs中含有多巴胺代謝酶。隨后，作者進一步證明hAECs可以攝取3，4二羥苯丙氨酸并將其轉化為DA[9]。乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)是一種影響神經(jīng)元和肌肉細胞生理特性的神經(jīng)遞質,由乙酰輔酶A和膽堿通過膽堿乙酰轉移酶(ChAT)催化合成。Sakuragawa 等[10]發(fā)現(xiàn)hAECs中存在ChAT，并能以時間依賴方式合成、釋放ACh。采用實驗性妊娠大鼠實驗進一步證明，子宮缺氧可促使AEC分泌ACh[11]。這些研究結果提示，hAECs可作為神經(jīng)退行性疾病細胞治療的供體細胞。

1.3 神經(jīng)營養(yǎng)作用 神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)等對神經(jīng)元具有營養(yǎng)保護[12]。BDNF可修復突觸可塑性，減輕突觸損傷，改善認知功能障礙[13]，BDNF減少是AD發(fā)生的因素之一[14]。NGF能減輕AD膽堿能神經(jīng)元損傷，它與基底前腦膽堿能神經(jīng)元酪氨酸激酶A( TrkA)受體結合后，能促進和維持海馬與皮層神經(jīng)元的突觸連接。NGF或BDNF缺乏，或者TrkA或TrkB受體改變，均可導致記憶形成障礙[15]。Uchida等[16]報道，hAECs能合成、釋放BDNF、NGF及NT-3。Kakishita等[17]發(fā)現(xiàn)無血清hAECs條件培養(yǎng)基可提高酪氨酸羥化酶(TH)陽性DA能神經(jīng)元的存活，保護其免受6-羥多巴胺(6-OHDA)引起的毒性損傷。hAECs的神經(jīng)營養(yǎng)作用還涉及DA能神經(jīng)元的分化和成熟。核受體相關因子1(Nurr1)和垂體同源盒家族因子3(Pitx3)是特異性轉錄因子，在腹側中腦DA能神經(jīng)元發(fā)育分化和生存維持過程中起決定作用[18-19]。DA轉運體(dopamine transporter,DAT)僅表達于多巴胺能神經(jīng)元中，能將DA迅速從細胞外轉運到突觸前神經(jīng)元胞質內，以維持DA穩(wěn)態(tài)[20]。Yang等[21]報道，用hAECs條件培養(yǎng)基誘導人臍帶血間充質干細胞后，DAT、TH、Nurr1和Pitx3表達上調，DA能樣神經(jīng)細胞明顯增多。這些研究結果表明，hAECs可通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子激活神經(jīng)細胞再生和誘導干細胞向神經(jīng)元分化。近期Leaw等[22]報道，hAECs可通過釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子介導小膠質細胞的免疫調節(jié)作用，進而減少圍產(chǎn)期小鼠腦損傷導致的神經(jīng)細胞死亡。激活素信號通路在人胚胎神經(jīng)發(fā)育的早期發(fā)展中起重要作用。hAECs能合成激活素A和頭蛋白(noggin)，前者可直接誘導后者mRNA表達[23]，說明hAECs中存在激活素信號途徑，提示在胚胎發(fā)育的早期，hAECs對胚胎神經(jīng)分化起重要支持作用。

2 hAECs對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用

2.1 治療神經(jīng)退行性疾病 阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)等是常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為記憶喪失、認知障礙、運動功能障礙和感覺缺失等，目前尚無根本有效的治療方法。已有資料表明，hAECs移植在治療神經(jīng)退行性疾病方面具良好的應用前景。

AD的主要病理特點是腦中β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)積聚，神經(jīng)元內tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結，突觸功能喪失等[24]。Xue等[25]報道，將hAECs移植入PPswe/PS1轉基因AD模型小鼠側腦室內，8周后仍可檢測到存活的移植細胞，并遷移至第三腦室；行為學水迷宮檢測顯示，細胞移植組AD模型小鼠空間記憶能力明顯改善；高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)海馬組織ACh水平升高，乙酰膽堿酯酶染色顯示海馬膽堿能神經(jīng)元軸突數(shù)目增多。炎癥和免疫反應是AD發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)，免疫細胞和免疫因子在AD炎性反應中發(fā)揮重要作用[26]。Aβ C端的T細胞表位(Aβ17-21和Aβ29-42 C端)是引起細胞毒作用的核心肽段，可誘導Th1細胞，促進炎癥反應。董世桃等[27]報道，脂多糖誘發(fā)的AD樣病變大鼠海馬區(qū)移植hAECs后，空間辨別性學習記憶能力明顯改善，海馬神經(jīng)元病損減輕，Aβ沉積減少，磷酸化Tau蛋白水平下降，ACh增加；外周血Th1和Th17細胞百分率明顯下降，Th2和FoxP3+Treg細胞明顯升高，IL-2和IFN-γ水平下調，IL-4上調，提示由hAECs介導的抗炎和免疫調節(jié)作用，可能在減輕AD神經(jīng)組織免疫損傷中發(fā)揮重要作用。

PD最顯著的病理特點是黑質DA神經(jīng)元漸進性死亡并伴有紋狀體DA合成減少，因此，DA能神經(jīng)療法是治療PD最重要的策略。有研究證實，BDNF、NT-3對DA能神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)支持作用，能改善DA能神經(jīng)元存活[28]。Kakishita等[29，17]研究證明，常規(guī)培養(yǎng)的hAECs中約有10%TH陽性細胞，移植到PD模型大鼠腦內的hAECs可釋放DA，并通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子阻止DA能神經(jīng)元的喪失。陳勇等[30]報道，hAECs移植到6-OHDA所致PD模型大鼠前腦內側束后，黑質TH表達上調，阿樸嗎啡誘導的旋轉偏位明顯改善。從目前的研究結果看，hAECs移植作為治療PD的DA能神經(jīng)療法具有潛在的應用前景。

2.2 治療多發(fā)性硬化 多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變和炎性細胞浸潤為特性的自身免疫性疾病，由T淋巴細胞尤其是Th1介導的免疫反應在MS的發(fā)病機制中起重要作用[31]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)具有與MS相似的行為學改變和病理特征，是普遍用于MS研究的動物模型。Mcdonald等[32]發(fā)現(xiàn)EAE小鼠腹腔注射hAECs后，臨床癥狀明顯改善，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的炎癥反應、脫髓鞘和軸突變性明顯減輕。郭禮和等[33]報道，EAE小鼠側腦室或尾靜脈注射hAECs 后，動物行為學和CNS病理改變均有明顯的改善和減輕。另有研究證明，hAECs對EAE模型的效應機制與其抑制CNS淋巴細胞和巨噬細胞浸潤,抑制Th17和Th1細胞應答，抑制促炎細胞因子IL-17的產(chǎn)生，誘導調節(jié)性T細胞等抗炎和免疫調節(jié)作用有關[34-36]。

2.3 治療缺血性腦損傷 缺血性腦損傷是一種因腦血管供血不足引起的腦損傷疾病，由缺血缺氧所引發(fā)的興奮性毒性、鈣超載、自由基損傷、炎性反應、神經(jīng)元凋亡等在該病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Okawa等[37]最先報道hAECs治療成年沙鼠腦缺血損傷，發(fā)現(xiàn)hAECs移植入海馬后可遷移到海馬CA1錐體層,并轉化成神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)干細胞。近期Evans等[38]報道，腦缺血小鼠模型移植hAECs后，腦炎癥、梗死發(fā)展和功能缺陷明顯減輕和緩解；hAECs可通過CXC趨化因子受體4依賴機制向缺血腦組織遷移；早期注射hAECs可有效控制絨猴的腦缺血后梗塞發(fā)展。

2.4 對脊髓損傷的修復作用 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后發(fā)生神經(jīng)細胞進行性死亡和軸突退化，導致嚴重的運動、感覺和自主功能障礙，目前尚無有效的治療方法。Sankar 等[39]報道，靈長類動物脊髓T11-T12完全橫斷后，將hAECs移植入節(jié)段腔內，60 d后受損脊髓節(jié)段周圍仍有hAECs存活，軸突間相互連接增加；移植后第8周后肢運動功能顯著改善，前后肢運動協(xié)調能力明顯提高，說明hAECs移植能恢復損傷的神經(jīng)傳導通路。另有研究指出，SCI大鼠原位移植hAECs后，能促進軸突的生長，可完全消除脊髓膠質瘢痕的形成[40]。此外，hAECs還能緩解SCI誘導的的機械性痛覺超敏。Roh等[41]報道，大鼠T13脊髓半切損傷13天后，機械性痛覺超敏(MA)和熱痛覺過敏(TH)加重；損傷后14 d，將hAECs移植到SCI部位，28天后MA明顯減弱，與痛敏感有關的NMDA受體亞單位 NR1磷酸化水平下調，小膠質細胞標志F4/80表達上調，說明hAECs抑制SCI誘導的機械性異常疼痛與其調節(jié)NR1磷酸化和小膠質細胞有關。

3 展望

hAECs能分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞，基于這一特性的hAECs替代治療，有望成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病新的途徑。其次，hAECs具有神經(jīng)細胞生化特性，如合成及分泌CA、ACh等神經(jīng)遞質，產(chǎn)生DAT，作為DA能神經(jīng)療法的工具，hAECs極具臨床應用前景。再有，hAECs可通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，為神經(jīng)細胞提供營養(yǎng)支持，促進神經(jīng)細胞再生，可廣泛用于神經(jīng)組織損傷的修復。還應強調，hAECs具有免疫豁免特性和免疫調節(jié)作用，這不僅有助于移植細胞的定植，而且可抑制因免疫反應過亢所致的病理損傷[42]。

最后，值得提出，hAECs在用于臨床之前仍有許多基礎性研究有待積累，例如，盡管hAECs植入腦組織后能分化成神經(jīng)元樣細胞，但能否與宿主神經(jīng)細胞形成新的神經(jīng)環(huán)路，起到恢復神經(jīng)功能的作用；hAECs在受者體內治療效應的持續(xù)性及其最終命運；hAECs可否因體外擴增發(fā)生上皮-間質轉化而影響其生物治療作用；hAECs制備的標準化程序及質控標準，等等，均值得深入探討。