陳 香， 朱麗巖， 王 超， 董輝輝， 沈 陽， 卜亞謙

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

四溴雙酚A (tetrabromobisphenol-A, TBBPA)是一種持久性有機污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)，易于在生物體內(nèi)富集，可在食物鏈和食物網(wǎng)中傳遞并產(chǎn)生毒性效應(yīng)[1-2]。另外，作為市場需求量最大的新型溴代阻燃劑(Brominated Flame Retardants, BFRs)[3-4]，TBBPA的污染問題日益嚴(yán)峻，有研究表明，在空氣、水體、沉積物和土壤等介質(zhì)以及水生生物甚至人體中都檢測到了TBBPA的存在[5]。

橈足類是浮游動物中最重要的組成部分，因其對污染物敏感，常被用來檢測海洋污染與評估風(fēng)險[6-7]。日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)是研究河口和海洋生態(tài)污染的模式物種，具有分布廣、易培養(yǎng)、生態(tài)特征顯著等特點。目前，橈足類已被廣泛應(yīng)用于毒性效應(yīng)研究，徐東暉等、Ida Beathe等和鞏文靜等分別研究了多環(huán)芳烴、Hg和TBBPA對橈足類的毒性效應(yīng)[10-12]。Kyun-Woo Lee等和Foley等分別指出污染物對日本虎斑猛水蚤的世代毒性和耐受力的影響[13-14]。另外，Shi等研究了HBCD在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的急性積累與發(fā)育毒性[8]。

溫度是影響橈足類生長和繁殖的重要因素[15]。溫度變化對污染物毒性效應(yīng)的影響已成為研究的焦點。Santhanam P等和Alexander K等分別研究不同的溫鹽度對橈足類的毒性效應(yīng)[16-17]。李光福等和韓萃等分別研究了溫度和鹽度對指狀偽鏢水蚤(Pseudodiaptomidaeinopinus)攝食和繁殖的影響以及溫、鹽度對擬長腹劍水蚤(Oithonasimilis)生長發(fā)育的影響[15,18]。胡媛媛和Kaisa Figueiredo分別測量了不同物質(zhì)在水生生物中的積累[19-20]。目前，關(guān)于環(huán)境因子作用下污染物在橈足類體內(nèi)多世代積累方面的報道較少。因此，本研究在攝食、產(chǎn)糞的基礎(chǔ)上系統(tǒng)探究了溫度對日本虎斑猛水蚤多世代積累TBBPA的影響，為自然環(huán)境下TBBPA在水生生物體內(nèi)的富集提供數(shù)據(jù)，有利于建立完善合理的TBBPA毒性評定標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1日本虎斑猛水蚤的培養(yǎng)

日本虎斑猛水蚤最初采集于山東省青島市匯泉灣附近海域，已在實驗室連續(xù)培養(yǎng)3年以上。日本虎斑猛水蚤的培養(yǎng)條件為溫度(20±1) ℃、鹽度30、光照周期12 h L∶12 h D。喂養(yǎng)青島大扁藻(PlatymonashellgolandicaKylinvarTsingtaoensis)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和活性干酵母溶液的混合餌料，投喂比例為5∶1∶2。

1.2 測試化學(xué)品

TBBPA固體從J&K化學(xué)試劑有限公司購買。根據(jù)以往文獻中的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計，用二甲亞砜(DMSO)配制濃度為10 g/L的溶液，隨后用過濾海水稀釋至50 mg/L并用于之后的實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性測試 實驗設(shè)有空白對照組、溶劑對照組D(DMSO)、1.59、2.385、3.577、5.366、8.049和12.07 mg·L-1TBBPA共八組。每組三個平行。每個平行組20只日本虎斑猛水蚤。實驗條件同培養(yǎng)條件。每24 h記錄水蚤死亡數(shù)并將死亡個體挑出。實驗持續(xù)48 h并計算48 h-LC50[18,24]。

1.3.2 攝食實驗 根據(jù)預(yù)實驗，設(shè)定日本虎斑猛水蚤的實驗溫度為18、20、23 ℃，馴化一周后開始實驗。實驗開始前饑餓處理24 h。采用餌料濃度差法計算攝食率和濾水率[21]。

根據(jù)急性毒性測試結(jié)果，將實驗的TBBPA濃度分別設(shè)定為48 h-LC50的1%、2.2%、5%、11%，并設(shè)置一個溶劑對照組、一個不加水蚤的藻液參照組，每組3個平行。實驗時，取對數(shù)生長期的扁藻，稀釋至105ind/mL分別置于100 mL的塑料瓶中(完全密封)，每瓶30只水蚤。黑暗環(huán)境下實驗24 h。為避免藻細胞沉降，每2 h晃動一次。實驗結(jié)束時，用魯哥試劑固定并用血球計數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計細胞個數(shù)。計算公式如下：

其中：F為濾水率(mL·ind-1·h-1)；G為攝食率(cells·ind-1·h-1)；V為實驗溶液體積(mL)；N為每個平行水蚤個數(shù)(ind)；c0為起始餌料濃度(cells/mL)；ct為對照組餌料終濃度(cells/mL)；ctf為實驗組餌料終濃度(cells/mL)；t為實驗周期(h)[12]。

1.3.3 產(chǎn)糞粒數(shù)實驗 日本虎斑猛水蚤的馴化、饑餓及TBBPA濃度如上。實驗時，將日本虎斑猛水蚤挑至12孔板，每孔一只，每組24個成年橈足類個體，投喂青島大扁藻(105ind/mL)，分別在18、20、23 ℃下實驗24 h后用魯哥試劑固定并在解剖鏡下計產(chǎn)糞粒數(shù)[15]。

1.3.4 生物富集實驗 水蚤的馴化條件如上。實驗分別在18、20和23 ℃下進行，并且根據(jù)48 h-LC50值，設(shè)置溶劑對照組、1/100 LC50組、5/100 LC50組。每組十二個平行，每個平行30只水蚤。挑選孵化時間<24 h的無節(jié)幼蟲置于六孔板中，曝光條件如上，待發(fā)育至成體階段。挑選約12只掛卵雌體至12孔板中待其孵化，將剩余成年橈足類收集，并保存于-80 ℃冰箱。待12孔板中的雌體孵化后，將F1代無節(jié)幼蟲置于六孔板中，實驗和曝光條件均與F0代一致。每24 h換水50%，記錄并挑出死亡個體[12,18,32]。

1.4 TBBPA含量的測定

1.4.1 分析條件 使用使用高效液相色譜儀(安捷倫1100)測定TBBPA含量。柱溫30 ℃，檢測波長209 nm，流動相為甲醇：去離子水=80∶20(v/v)，流速1 mL/min，進樣體積20 μL[22-23]。

1.4.2 質(zhì)量控制 按照上述方法處理空白樣品，測定結(jié)果對樣品無影響，依次加入0.1、1、5、10、25和50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組溶液做3個平行，測定信噪比S/N>3時，方法檢出限是0.01 μg/mL，平均回收率為89.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.3%。

1.5 生物富集因子

生物富集因子(Bioaccumulation Factor，BAF)的計算公式為:BAF=Corg/Cw，其中：Corg為生物體內(nèi)TBBPA的濕重濃度(ng/kg)，Cw為海水溶解態(tài)TBBPA的濃度(ng/L)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運用Excel對數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計處理。采用SPSS16.0對實驗數(shù)據(jù)作統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 TBBPA對日本虎斑猛水蚤的48 h-LC50

實驗結(jié)果經(jīng)SPSS16.0線性分析后，得出TBBPA對日本虎斑猛水蚤的48 h-LC50是4.423 mg/L。

2.2 不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤攝食率和濾水率的影響

毒性暴露24 h后，比較TBBPA濃度對攝食率和濾水率的影響。18 ℃下(見圖1A)，攝食率和濾水率隨濃度升高而升高，97、221和487 μg/L均顯著高于對照組(p<0.05)。20 ℃下(見圖1B)，在一定濃度范圍內(nèi)，水蚤的攝食率和濾水率呈現(xiàn)先升高(p>0.05)后顯著降低的變化趨勢(p<0.05)，在44 μg/L濃度下，攝食率和濾水率最高，分別為8 377.2 cells·ind-1·h-1和0.268 mL·ind-1·h-1；在97 μg/L的濃度下，攝食率最低，為7 583.9 cells·ind-1·h-1。23 ℃下(見圖1C)，隨著TBBPA濃度的升高，攝食率和濾水率呈現(xiàn)先降低(p>0.05)后增加再降低的趨勢(p<0.05)，在221 μg/L濃度下，攝食率和濾水率達到最大，分別是7 324.8 cells·ind-1·h-1和0.221 mL·ind-1·h-1(見圖1)。

比較溫度對攝食率和濾水率的影響。在20 ℃時，兩者達到最高(除221 μg/L濃度組的濾水率外)；18 ℃時最低，顯著(p<0.05)低于20和23 ℃；487 μg/L濃度下各溫度攝食組無顯著差異(P>0.05)。20和23 ℃的攝食率和濾水率只在44 μg/L的濃度組中差異顯著(P<0.05)(見圖2)。

(A、B、C分別表示18、20、23 ℃；不同字母表示p<0.05，顯著相關(guān)。相同字母表示p>0.05，不相關(guān)。A,B and C mean 18,20 and 23 ℃, respectively. The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖1 不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率
Fig.1 Feeding rate and filtration rate ofTigriopusjaponicusunder different concentration of TBBPA

(A、B分別表示攝食率和濾水率；不同字母表示p<0.05，顯著相關(guān)；相同字母表示p>0.05，不相關(guān)。A and B mean feeding rate and filtration rate, respectively.The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖2 不同溫度下日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率
Fig.2 Feeding rate and filtration rate ofT.japonicusunder different temperature

2.3 不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤產(chǎn)糞粒數(shù)的影響

TBBPA暴露24 h后，不同溫度下日本虎斑猛水蚤的產(chǎn)糞粒數(shù)如圖3。18 ℃下，產(chǎn)糞粒數(shù)只在高濃度組(487 μg/L)顯著下降(p<0.05)，為15.8粒。20 ℃下，在所有實驗組中，產(chǎn)糞粒數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在44 μg/L濃度下有最大值，為28.3粒。23 ℃下，44、97、487 μg/L濃度組均與對照組差異顯著(p<0.05)。

產(chǎn)糞粒數(shù)隨溫度的升高而升高。18 ℃組顯著低于20、23 ℃組。44 μg/L濃度組在20和23 ℃之間無顯著差異。97、221和487 μg/L濃度組中，23 ℃組顯著高于20 ℃組(p<0.05)。

2.4 不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤兩世代富集的影響

2.4.1 日本虎斑猛水蚤體內(nèi)富集的TBBPA濃度 TBBPA暴露兩世代后，F(xiàn)0代和F1代橈足類體內(nèi)的TBBPA濃度都隨著溶液濃度的升高顯著增加。由于23 ℃的低濃度組數(shù)據(jù)丟失，所以之后的實驗未討論。在F0代(見圖4A)，44 μg/L的濃度下，20 ℃組水蚤體內(nèi)TBBPA含量低于18 ℃組，僅為0.732 4 mg/g ww；220 μg/L濃度下，20 ℃組顯著低于其他溫度組，只有2.918 mg/g ww，23 ℃濃度值最大，為3.481 8 mg/g ww。在F1代(見圖4B)，44 μg/L濃度組在各溫度之間無顯著差異，但是220 μg/L濃度組，各溫度之間差異顯著(p<0.05)，在20 ℃最低，為3.027 mg/g ww；23 ℃最大，達到3.933 4 mg/g ww(見圖4)。

(不同字母表示p<0.05，顯著相關(guān)；相同字母表示p>0.05，不相關(guān)。The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖3 不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的產(chǎn)糞粒數(shù)
Fig.3 Feces production ofT.japonicusunder different temperature and concentration of TBBPA

(A、B分別表示F0和F1代；不同字母表示p<0.05，顯著相關(guān)；相同字母表示p>0.05，不相關(guān)。A and B mean F0 and F1, respectively;The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖4 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤體內(nèi)富集的TBBPA濃度
Fig.4 Concentration of TBBPA ofT.japonicusexpose to various concentrations of TBBPA under different temperature

日本虎斑猛水蚤兩世代共同積累TBBPA的濃度如圖5，與F0代相比，F(xiàn)1代均有不同程度的增加。在44 μg/L濃度組中，F(xiàn)1代水蚤體內(nèi)的TBBPA含量顯著高于F0代，18 ℃組和20 ℃組分別增加了20 %和40 %以上。在220 μg/L濃度組中，18 ℃和23 ℃組都增加了10 %以上。兩世代共同積累的TBBPA含量相比，只有220 μg/L濃度組在各溫度間差異顯著(p<0.05)，其中23 ℃下的220 μg/L濃度組最大，達到了7.414 4 mg/g ww。20 ℃下的44 μg/L濃度組最小為1.813 8 mg/g ww。

2.4.2 BAF的變化 毒性暴露兩世代后，在F0代(見圖6A)，44 μg/L濃度組中，18 ℃組的BAF最大，為19.89×103，20 ℃組較低；220 μg/L濃度組中，所有溫度組的BAF均小于44 μg/L濃度組，其中20 ℃組最小，為13.26×103。在F1代(見圖6B)，44 μg/L濃度組的BAF增加至持平，220 μg/L濃度組與F0代分布值一致(見圖6)。

毒性暴露兩世代后，F(xiàn)1代的BAF高于F0代，在44 μg/L濃度組中增加尤其顯著。在44 μg/L濃度組中，20 ℃組的BAF增加較快，在F1代已經(jīng)超過18 ℃組。而在220 μg/L濃度組中，F(xiàn)0和F1兩個世代中均是23 ℃組的BAF最高，分別是15.83×103和17.88×103，20 ℃組最低，分別為13.26×103和13.76×103(見圖7)。

(純色表示F0代；星點表示F1代。Pore color means F0； Star means F1.)

圖5 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤體內(nèi)兩世代積累含量
Fig.5 Two generations of TBBPA concentration ofT.japonicusexpose to various concentrations of TBBPA under different temperature

(A、B分別表示F0和F1代。A and B mean F0 and F1, respectively.)圖6 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的生物富集因子Fig.6 BAF of T.japonicus expose to various concentrations of TBBPA under different temperature

(A、B分別表示44和220 μg/L。A and B mean 44 and 220 μg/L, respectively.)圖7 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的兩世代富集因子Fig.7 Two generations BAF of T.japonicus expose to various concentrations of TBBPA under different temperature

3 討論

3.1 日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率

有報道稱，橈足類體內(nèi)富含脂肪酸，在一定的暴露途徑中能夠富集某些化合物，從而產(chǎn)生不利的影響，如攝食活動紊亂、新陳代謝變化等[12]。本研究中，不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤攝食率和濾水率的影響不同。常溫下的結(jié)果與徐風(fēng)風(fēng)等的結(jié)果基本一致，呈現(xiàn)這種結(jié)果可能是由于低濃度下水蚤因代謝消耗能量而輕微增加攝食，而高濃度的TBBPA則完全影響了水蚤的正?；顒?，致使水蚤產(chǎn)生了躲避行為從而減少攝食[24]。高溫條件下221 μg/L濃度組促進水蚤攝食，其他濃度組都不同程度的抑制了水蚤攝食，結(jié)合此濃度下的產(chǎn)糞粒數(shù)小而積累濃度卻大，這樣的結(jié)果正好與較大的攝食率和濾水率相對應(yīng)。另外，劉麗華等發(fā)現(xiàn)PDBEs具有一定的神經(jīng)毒性，而神經(jīng)系統(tǒng)能夠在一定程度上調(diào)控橈足類的攝食活動[25]，所以TBBPA也可能會通過影響水蚤的神經(jīng)系統(tǒng)而影響攝食和濾水。攝食率和濾水率在各溫度之間比較結(jié)果顯示，常溫>高溫>低溫(除221 μg/L濃度組的濾水率外)，本結(jié)果與薛澤等和李光福等的結(jié)果基本一致[15,26]。溫度是影響橈足類攝食的主要因素之一，隨著溫度的升高，橈足類代謝增強，所需能量增加，攝食率和濾水率也增加，但是當(dāng)溫度超過其最適值之后，代謝就會受到抑制，攝食率和濾水率也會下降[27]。Changling Li等也指出橈足類的攝食率和濾水率隨著溫度的升高而升高[28]。

3.2 日本虎斑猛水蚤的產(chǎn)糞粒數(shù)

糞?？梢栽谝欢ǔ潭壬戏磻?yīng)橈足類排出污染物的濃度。本研究中日本虎斑猛水蚤的24 h產(chǎn)糞粒數(shù)隨著濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在各溫度間則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，而李光福等的研究中隨著溫度增加，產(chǎn)糞顆粒先增加后減少[15]，結(jié)果稍有不同，可能是本次研究溫度設(shè)置范圍較小的原因，沒有包括水蚤的最適產(chǎn)糞粒溫度。而在TBBPA影響下各濃度組表現(xiàn)出了不同的抑制或促進現(xiàn)象，在低濃度組(44 μg/L)中，日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率更高，但是體內(nèi)積累的TBBPA含量卻少，我們猜測這樣的結(jié)果是由于水蚤較高的產(chǎn)糞粒數(shù)造成的，而高濃度組(487 μg/L)相反的結(jié)果也能在一定程度上驗證我們的猜測。產(chǎn)糞粒數(shù)的變化側(cè)面反映了溫度和TBBPA對水蚤攝食和消化代謝的影響，有助于分析水蚤對污染物的積累情況，更有利于水蚤的生長繁殖。

3.3 日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的TBBPA濃度

TBBPA具有高親脂性、低水溶性的特點，易于在沉積物、生物體中積累[29]，浮游動物等小型水生生物極易受到影響，一旦它們在體內(nèi)富集，污染物就會沿著食物鏈和食物網(wǎng)傳遞，對高營養(yǎng)級生物造成毒性效應(yīng)[29-30]。本研究中，日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的TBBPA濃度隨著溶液濃度的升高顯著增加，這是因為水體中的TBBPA會通過橈足類攝食等途徑進入體內(nèi)[31]。江田田等也曾指出浮游動物體內(nèi)TBBPA的濃度與海水濃度變化相一致。另外，生物體可以通過產(chǎn)卵等方式將污染物傳遞給后代[32]，因此后代就具有相對較大的基數(shù)，當(dāng)后代處于同樣的環(huán)境中時，富集的污染物量勢必高于親代，這與本研究中的結(jié)論一致。在兩個濃度組的兩世代增加比例來看，低濃度的TBBPA在橈足類中具有更大的增加比率。鞏文靜等人的研究也表明，TBBPA在指狀偽鏢水蚤中具有傳代積累毒性[12]。

TBBPA富集量在各溫度之間的比較顯示，高溫(23℃)>低溫(18℃)>常溫(20℃)，這可能是由于不同的吸收消化效率造成的[32]。結(jié)合攝食率、濾水率和產(chǎn)糞顆粒的結(jié)果，水蚤在常溫下具有最高的攝食率和濾水率，而產(chǎn)糞顆粒卻不是最高，富集量最小，這是因為水蚤的糞便是由餌料代謝產(chǎn)生的[24]，本次研究投喂的餌料未染毒，通過濾水?dāng)z入體內(nèi)的TBBPA有一部分隨糞便排出，出現(xiàn)常溫組富集量最小的現(xiàn)象。而一定范圍內(nèi)的低溫和高溫，都會增加TBBPA在水蚤體內(nèi)積累的幾率[15]。Siriporn等也曾指出溫度會影響B(tài)PA在生物體內(nèi)的積累[33]。

3.4 生物富集因子(BAF)

生物富集因子(BAF)代表生物體對污染物的富集能力。江田田等人測定夏冬兩季渤、黃海浮游動物對TBBPA的富集因子平均值分別為14.396×103和14.839×103，logBAF范圍分別是3.26～4.80和3.07～4.59[32]。本研究結(jié)果在其范圍內(nèi)，表明日本虎斑猛水蚤對TBBPA具有較強的生物富集性(BAF>5 000)。隨著世代的增加，BAF也增加，且低濃度組增幅較大。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著日本虎斑猛水蚤體內(nèi)TBBPA濃度的增加，BAF顯著增加，但是當(dāng)溶液中TBBPA濃度增加時，BAF卻降低，這樣的結(jié)論與江田田和李學(xué)鵬的結(jié)論一致。李學(xué)鵬等還指出影響B(tài)AF的因素主要包括溫度等環(huán)境因素和生物量等生物因素[34]，本次研究結(jié)果也證明了這一觀點。

綜上所述，在溫度的作用下，TBBPA對日本虎斑猛水蚤的攝食、產(chǎn)糞以及富集都有不同程度的影響。低濃度的TBBPA能夠促進攝食與產(chǎn)糞，并且隨溫度升高而增加。在日本虎斑猛水蚤富集TBBPA方面，BAF偏高，水蚤體內(nèi)的富集量隨溶液濃度的升高而增加，并且具有明顯的世代效應(yīng)；當(dāng)改變溫度時，富集量和BAF也發(fā)生一定程度的變化。因此在水體污染日漸嚴(yán)重和氣溫逐漸增加的當(dāng)前環(huán)境中，研究以日本虎斑猛水蚤為代表的橈足類的富集情況，可以為評估海洋生物富集能力提供依據(jù)，有利于水生生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展。