林豐夏，李 亮，曾志聰，宋銀枝

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、腦梗死等心腦血管疾病發(fā)病基礎(chǔ)，因其有非常高的發(fā)病率和死亡率，所以引起廣泛重視[1]。盡管以調(diào)脂、抗血小板凝聚等為核心的動脈粥樣硬化疾病的防治手段不斷推進(jìn)，但AS仍是威脅發(fā)達(dá)國家與發(fā)展中國家人類健康的“罪魁禍?zhǔn)住?。近年來中醫(yī)藥在動脈粥樣硬化性疾病防治上取得許多可喜成果。辨證論治是中醫(yī)學(xué)的特色，在AS的中醫(yī)診治中具有關(guān)鍵性的作用。對于AS的辨證分型存在地域性差異，溫暖潮濕的嶺南地區(qū)病人則以濕熱證為主[2]，而寒冷的西北地區(qū)病人以陽虛證多見[3]。不同證型的AS，遣方用藥可截然相反。對于中醫(yī)藥的研究不能停留在“只見樹木不見森林”的程度，在實驗研究中堅持“整體觀”與“辨證論治”原則，可讓傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域充分接洽。因此完成“濕熱證”與“陽虛證”AS動物模型的建立，在研究AS不同證型的病理特征及驗證中醫(yī)辨證論治的思想有重要意義。隨著“濕熱證”與“陽虛證”AS模型的建立，將進(jìn)一步了解不同證型AS的病理特點。對于濕熱證的AS模型，在其模型上使用小檗堿等清熱祛濕藥物是“正治”，其效果是否較“陽虛證”AS模型好？若在“濕熱證”AS模型使用已證實具有改善AS的辛溫通陽藥物(如蔥白提取物等[4])還能否取得良好效果？這些設(shè)想將在“濕熱證”與“陽虛證”AS模型建立的基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確中醫(yī)辨證論治的重要性。

鑒于此，本研究通過對既往文獻(xiàn)的檢索、閱讀、理解提煉，加入簡單評述，探討建立動脈粥樣硬化疾病中常見的兩種中醫(yī)證型(濕熱證、陽虛證)動物模型的建立方法，為進(jìn)一步揭示中醫(yī)中藥在防治動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制提供幫助。

1 AS實驗動物選擇

AS是一種慢性的血管病變，建模時間一般較久，故需要選擇與人類的血管解剖特點相似、生命力及抗感染能力較強(qiáng)的實驗動物。常用的動物模型包括大鼠、小鼠、兔、小型豬等。

1.1 大鼠 大鼠容易飼養(yǎng)，生命力頑強(qiáng)，且大鼠為雜食性動物，食性特點與人類相似，手術(shù)耐受性好[5]。因此基于大鼠建立AS模型的研究較多，如邢玉桂等[6]利用8周齡的Wistar大鼠，經(jīng)高脂高糖飲食+維生素D3灌胃8周后，成功制作出動脈粥樣硬化大鼠模型；賴玲等[7]利用健康成年的SD雄性大鼠，高脂飲食+維生素D3+L-甲硫氨酸喂養(yǎng)4周、6周、8周后，SD大鼠分別出現(xiàn)了動脈粥樣硬化早、中、晚期的典型改變。有學(xué)者應(yīng)用高脂飲食配合免疫損傷，比較了HFJ近交系大鼠與Wistar封閉群大鼠在AS模型建立中的優(yōu)劣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFJ大鼠造模成功率優(yōu)于Wistar大鼠，可作為新一代的AS動物模型[8]。但HFJ大鼠體形及動脈較小，無膽囊，對外源性膽固醇吸收差，具有抗實驗性 AS 特性等不利因素[5]，制約了其進(jìn)一步發(fā)展。

1.2 小鼠 基于小鼠建立的 AS 動物模型的研究最為廣泛，主要是因為小鼠的病變過程與人類相似，另外小鼠價格低廉、飼養(yǎng)成本低、易于繁殖、可進(jìn)行基因操作的特點也很大程度上促進(jìn)了小鼠的應(yīng)用。同時其發(fā)病周期相對較短，這有利于觀察與操作[9]。隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步、轉(zhuǎn)基因與基因敲除等技術(shù)的出現(xiàn)，誕生的新型轉(zhuǎn)基因AS模型小鼠更具有獨特優(yōu)勢。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺陷株(ApoE-/-)小鼠和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受體缺陷株(LDL-R-/-)小鼠是當(dāng)前研究、應(yīng)用最成熟的模型小鼠。ApoE-/-小鼠在正常的飲食情況下也會自發(fā)出現(xiàn)動脈粥樣硬化，配合高脂飼養(yǎng)能更快產(chǎn)生易損斑塊或形成血栓，AS模型的成功概率會明顯增加[10]。但ApoE-/-小鼠缺乏在人類AS病變過程中非常重要的LDL，其血漿中的膽固醇主要被脂蛋白殘粒所運載而非LDL，且ApoE蛋白同時還具有影響免疫功能及巨噬細(xì)胞、脂肪組織的生理功能，而這些均參與AS形成過程，所以將分析其具體機(jī)制[11]。 LDL-R-/-小鼠的優(yōu)勢在于LDL受體(LDLR)蛋白的缺失主要影響脂蛋白的攝取和清除，較ApoE-/-具有功能單一性，但LDL-R-/-小鼠不采用高脂高糖飲食難以產(chǎn)生滿意的AS模型，造模成功的概率相對較低[12]。總之，轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過高脂飲食喂養(yǎng)后容易產(chǎn)生AS模型且病變過程與人類相似，近年來已成為AS動物模型制作的主要實驗動物。

1.3 豬 豬不但心臟、血管等結(jié)構(gòu)在解剖和功能，包括血液學(xué)特點和血液的生化指標(biāo)，都與人類極其相似。而且其脂質(zhì)代謝機(jī)制也和人類相仿，其形成AS斑塊的分布、組織結(jié)構(gòu)和發(fā)病機(jī)制也與人類相近[13]。以往受限于家豬的較大體型、飼養(yǎng)管理與操作困難、維持成本高、研究者不熟悉等缺點，其應(yīng)用不廣泛。但近年來培育的小型豬相對解決了這些不足，應(yīng)用小型豬制作動脈粥樣硬化模型的研究越來越多。李艷君等[14]通過高脂、高熱量方法飼養(yǎng)廣西巴馬小型豬半年，發(fā)現(xiàn)其主動脈、頸動脈、腹動脈內(nèi)膜均明顯增厚，內(nèi)膜下可觀察到少量的泡沫細(xì)胞，并且觀察到動脈粥樣硬化指數(shù)值達(dá)到3.8以上并維持3個月，即可初步認(rèn)定AS模型建立成功。

1.4 其他AS動物模型 目前報道的文獻(xiàn)，還有利用兔、鴿、猴子、鵪鶉等實驗動物制作AS動物模型。兔對外源性的膽固醇吸收率高，且體內(nèi)脂質(zhì)不易清除，采用不同的飼養(yǎng)方法可形成不同的AS類型，且具有大小合適、喂養(yǎng)成本相對可接受等特點，但因為其是食草動物，不能自發(fā)形成AS動物模型，免疫力低下，死亡率較高，造模周期長等不足限制了其應(yīng)用[5]。田卉等[15]利用高脂+煙酰水楊酸75 mg/(kg·d)喂養(yǎng)鵪鶉6周后，高脂喂養(yǎng)的兩組動物血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(how density lipoprotein cholesterol，HDL-C)升高，動脈斑塊發(fā)生率達(dá)到100%，但其缺點在于血管特點與人類不相近。猴子經(jīng)過高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)后，可產(chǎn)生與人類類似的AS病變[16]，但猴子作為靈長類保護(hù)動物，價格昂貴，使用受到限制。

2 AS動物模型復(fù)制方法

AS相關(guān)的研究很多，根據(jù)AS不同的發(fā)病機(jī)制，AS動物模型的制作方法也很多。比如基于脂質(zhì)浸潤學(xué)說，采用高脂高膽固醇喂養(yǎng)的方法被研究者廣泛使用；基于內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說，采用機(jī)械損傷的方法制作AS模型；基于免疫損傷學(xué)說，采用免疫損傷法等。各種復(fù)制方法均有其優(yōu)缺點。

2.1 高脂高膽固醇飼喂法 基于脂質(zhì)浸潤學(xué)說，采用高脂飲食的喂養(yǎng)方法，接近人類飲食，制作成功的AS動物模型病變特點近似人類。文依等[17]將膽固醇溶解于乙醇后與普通飼料混勻配成高膽固醇飼料(1.5 g膽固醇配148.5 g普通飼料)，喂養(yǎng)新西蘭兔12周后成功造模；李淑蓮等[18]在普通飼料中添加10 %膽固醇和20 %豬油乳劑，連續(xù)喂養(yǎng)日本大耳白兔8周成功造模。但目前在飼料成分種類、配伍比例未達(dá)成共識，而且造模時間較長，這均為其缺點。

目前常用混合型飼料的喂養(yǎng)方法，該法克服了單純高脂飲食喂養(yǎng)的動物模型病變血管無鈣質(zhì)沉積缺陷，并且可以加速AS的形成，縮短試驗周期。賴玲等[7]利用高脂飲食+維生素D3+L-甲硫氨酸喂養(yǎng)健康成年的SD雄性大鼠，其中模型組分為3組，模型一組采用30%蛋黃粉、25%花生、34.3%基礎(chǔ)飼料、0.7%礦物質(zhì)維生素、10%豬油喂養(yǎng)；模型二組采用3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；模型三組采用1%膽固醇、0.4%膽酸、5%豬油、93.6%基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，在第4周、第6周、第8周測定大鼠血脂，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清 TG、TC 和 LDL與對照組相比均呈現(xiàn)上升趨勢，而高密度脂蛋白(HDL)則呈下降趨勢，高脂飲食+維生素D3+L-甲硫氨酸三則聯(lián)合的方法最終加速了AS的形成，且認(rèn)為模型一組喂養(yǎng)方式形成的模型更適合建立AS早中晚模型，適用于基礎(chǔ)、臨床多方面研究。

2.2 機(jī)械損傷法 基于內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說，采用機(jī)械損傷的方法刺激內(nèi)皮細(xì)胞致其大量損傷，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能發(fā)生紊亂，產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)和內(nèi)膜反應(yīng)，最終可形成AS。目前有采用球囊法、氣體干燥法、輻射損傷法成功制作AS模型的報道，其中采用球囊法的報道相對較多。楊炯等[19]利用短期的高脂飲食喂養(yǎng)+球囊損傷的方法成功建立了ApoE-/-小鼠AS模型，且認(rèn)為該法造模具有周期短、斑塊形成穩(wěn)定、病變部位明確、與人類AS性質(zhì)接近等優(yōu)勢，可作為AS小鼠模型更為合適的造模方法，適用于血管再狹窄的研究。但是球囊法造模也有其缺點，包括技術(shù)操作要求高、所形成的斑塊易破裂而形成血栓，球囊的應(yīng)用不當(dāng)可能會造成動脈破裂后果。艾志兵等[20]采用高脂飲食聯(lián)合氣體干燥法，在高糖高膽固醇飼養(yǎng)日本大耳白兔1周后于頸動脈處進(jìn)行氣體干燥術(shù)，術(shù)后繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第4周、第6周即可出現(xiàn)頸病變。目前關(guān)于氣體干燥法在干燥的時間、氣體用量方面沒有達(dá)成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有待進(jìn)一步研究。

2.3 免疫損傷法 基于免疫損傷學(xué)說，許多學(xué)者采用免疫損傷制作AS模型，取得一定成果。張勇等[21]通過靜脈注射牛血清白蛋白(250 mg/kg)+高脂飲食喂養(yǎng)干預(yù)日本大耳白兔3周后，血清中TC、LDL-C明顯升高，6周后，肉眼及光鏡下都發(fā)現(xiàn)明顯的動脈粥樣斑塊；連偉光等[8]則利用通過牛血清白蛋白(40 mg/kg) 和卵清白蛋白(2.5 mg/kg)進(jìn)行免疫損傷，并輔以維生素D3(250 U/g)灌胃，經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)90 d后，成功建立HFJ近交系大鼠AS模型；王衛(wèi)群等[22]在1周、3周分別經(jīng)新西蘭白兔鼻腔感染肺炎衣原體，發(fā)現(xiàn)肺炎衣原體感染與高脂飲食能誘發(fā)及加快AS病變進(jìn)程。此外許多學(xué)者采用內(nèi)毒素、鼠傷寒沙門氏菌等作為炎性刺激導(dǎo)致免疫損傷，而成功建立AS模型[23-24]。

3 AS中醫(yī)濕熱證模型

中醫(yī)濕熱證包含外感濕熱與內(nèi)傷濕熱，常見的證型有脾胃濕熱證、肝膽濕熱證、濕熱下注證等。在濕熱證的形成上，吳鞠通認(rèn)為“內(nèi)不能運化水谷之濕，外復(fù)感時令之濕”，薛生白則有“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”的精彩論述。由此可見濕熱證以脾胃為中心，內(nèi)傷外感共作而致病?！秲?nèi)經(jīng)·素問·太陰陽明論》：“脾者土也，治中央，常以四時長四藏，各十八日寄治”。長夏為四時之余氣，五臟歸屬于脾，脾主運化水濕。所以根據(jù)這些理論，多數(shù)學(xué)者在制作濕熱證模型時，多注意模擬長夏的氣候特點，改變模型動物喂養(yǎng)環(huán)境的濕度和溫度，增加其外感濕熱邪毒的機(jī)會；同時應(yīng)用高脂飲食喂養(yǎng)，制造飲食失節(jié)、過食肥甘厚膩的辦法損傷脾胃，致實驗動物脾胃失其運化，達(dá)到產(chǎn)生內(nèi)濕的目的。

吳仕九等[23]提出了飲食+氣候+生物因子(鼠傷寒沙門氏菌)的造模方法，將大鼠高熱量、高膽固醇喂養(yǎng)10 d后放入氣候箱(溫度35 ℃，相對濕度95%)96 h，再灌胃給子鼠傷寒沙門氏菌2 mL/200 g，120 h后再加強(qiáng)感染1次(1 mL/200 g)，成功復(fù)制濕熱證模型，并且認(rèn)為其模型從病因模擬、癥狀體征表現(xiàn)都與中醫(yī)濕熱證型相近，且有可重復(fù)性及可操作性的優(yōu)勢[23]。楊開清等[24]以高膽固醇飼料喂養(yǎng)6周+從耳緣靜注內(nèi)毒素(1 pg/kg，每周1次)的方法，成功制作了新西蘭大白兔濕熱證AS模型，并且認(rèn)為濕熱內(nèi)蘊是動脈粥樣硬化(特別是早期)重要的發(fā)病機(jī)制，濕熱進(jìn)一步致瘀，所以采用清熱化濕消瘀法是AS治療的主要方法。

總之，依據(jù)濕熱證形成中以脾胃為中心，內(nèi)外合邪而致病理論，結(jié)合目前常用制造AS動物模型的方法中高脂飲食喂養(yǎng)方法，加上增加動物生活環(huán)境濕度和熱度產(chǎn)生濕熱外邪，可以成功制作既具有中醫(yī)濕熱證典型特點，又符合AS病理改變特點的AS動物模型。

4 AS中醫(yī)陽虛證模型

中醫(yī)陽虛證主要包括心陽虛、脾陽虛、腎陽虛及多者相兼為病。關(guān)于陽虛證形成，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問·陰陽應(yīng)象大論》中提到“陰勝則陽病，陽勝則陰病”，基于此中醫(yī)多認(rèn)為陽虛證的形成與過食生冷、久居陰冷潮濕之地、久病陽氣耗傷等后天因素和先天稟賦不足有關(guān)。氣屬陽，氣虛為陽虛之漸，陽虛為氣虛之極，氣作為運行于生命周身的無形精微物質(zhì)，是保持機(jī)體生命活力的力量源泉。氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣虛、陽虛無力推動血液運行則血為之瘀，正如《仁齋直指方·血榮氣衛(wèi)氣論》所說：“蓋氣者，血之帥也。氣行則血行，氣止則血止，氣溫則血滑，氣寒則血凝，氣有一息之不運，則血有一息之不行?！标P(guān)于陽虛血瘀導(dǎo)致血府(脈管)病變，《靈樞·九針論第七十八》有載“邪入于陰，則為血痹?！薄吨T病源候論》中亦有記載：“血痹者，由體虛邪入于陰經(jīng)故也。血為陰，邪入于血而痹，故為血痹也。”《醫(yī)林改錯·下卷》中也指出：“元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而癖?！被谶@些理論，多數(shù)學(xué)者在復(fù)制陽虛證動物模型時多通過制造陰冷潮濕的環(huán)境、飲食不節(jié)等制造陽虛證形成的后天因素，或者通過手術(shù)等方式制造陽虛證形成的先天不足因素，以此形成外感寒濕等傷其陽氣、先天不足陽氣不充格局，達(dá)到復(fù)制陽虛證動物模型的目的。

如李芹等[25]系統(tǒng)綜述了脾陽虛證動物模型的建立方法，包括利用苦寒瀉下藥(大黃、番瀉葉等)灌胃、將動物模型放置在寒濕環(huán)境中、連續(xù)喂養(yǎng)的飲食失節(jié)等法模擬外感內(nèi)傷病因均能成功制造脾陽虛證模型；還有通過注射利血平等西藥建立脾陽虛模型，并且認(rèn)為評價脾陽虛模型的癥狀指標(biāo)包括納差、倦怠少動、大便溏泄、皮毛枯槁、肛溫下降、喜聚堆等。氫化可的松等激素注射及切除動物一側(cè)腎臟、腎上腺、睪丸等手術(shù)方式也可成功制作陽虛證動物模型[26]。唐漢慶等[27]通過手術(shù)切除Wistar大鼠肩胛骨棕色脂肪后1周，在19 ℃的環(huán)境刺激下，飼以高脂飼料后大鼠出現(xiàn)畏冷寒戰(zhàn)、喜扎堆、納差、便溏等陽虛癥狀或體征，成功制作冠心病心脾陽虛證。于柏青等[28]利用人工氣候箱模擬西北寒冷干燥環(huán)境[人工氣候箱系統(tǒng)溫度設(shè)定為(6±2)℃，相對濕度控制在25%～32.8%]，配合高脂飲食成功建立陽虛證AS模型。

通過對目前已發(fā)表的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，復(fù)制陽虛證動物模型的方法很多，復(fù)制動脈粥樣硬化陽虛證模型的研究則非常少，個別的報道散在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、下肢動脈粥樣硬化性疾病等研究中?；跉馓撗?、陽虛血瘀、陽虛寒凝等理論，以及臨床動脈粥樣硬化性疾病氣虛、陽虛證型的較高發(fā)病率，許凌之等[3]分析1 264例動脈粥樣硬化病人的中醫(yī)證候，提示以氣虛、陽虛為主證，或兼有氣虛、陽虛證的病人比例達(dá)到42.09%。因此探索建立具有陽虛特點的動脈粥樣硬化動物模型具有重要意義。

5 小結(jié)與展望

醫(yī)學(xué)動物模型的出現(xiàn)是人們了解疾病發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)，了解人體生理病理的一把利劍，醫(yī)學(xué)動物模型的出現(xiàn)是當(dāng)今醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展的一個重要原因，建立醫(yī)學(xué)動物模型是為了更好地防治疾病、服務(wù)臨床，為人類健康保駕護(hù)航，但是無論是建立何種醫(yī)學(xué)動物模型，復(fù)制出的模型與疾病表現(xiàn)在人類身上的征象都有一定的差異。所以建立醫(yī)學(xué)動物模型的關(guān)鍵，必須基于研究的目的，遵循目前以了解的疾病發(fā)病機(jī)制，采取合適的方法盡可能模擬近似人類疾病病理特點的動物模型。因此，無論是建立何種證型的AS動物模型，都必須符合AS的發(fā)病機(jī)制，符合中醫(yī)病因病機(jī)特點?；跐駸嶙C脾胃為中心，內(nèi)外合邪的致病理論，造模過程中盡可能地模仿內(nèi)濕外濕致病的先后天因素；基于陽虛證陰勝則陽病的理論，造模也要盡可能地營造能導(dǎo)致陽虛的先后天條件，如此復(fù)制出的AS動物模型才能更好地服務(wù)于基礎(chǔ)研究、臨床研究。

目前AS動物模型的造模途徑很多，選用的材料與方法各異，模型動物的選擇上，有用大鼠、小鼠，也有用兔、豬、鴿、猴子、鵪鶉等，各小類之間又有不同的區(qū)別，它們各有自己優(yōu)缺點，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越先進(jìn)的動物模型會不斷涌現(xiàn)，就目前來說，ApoE-/-與 LDL-R-/-等基因敲除小鼠因具有病變過程與人類相似、易于繁殖、維持成本低等優(yōu)勢，是建立AS模型較好的選擇。在造模方法上，目前方法很多，多數(shù)方法都沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，比如高脂高膽固醇飼料在具體配伍方面各學(xué)者采用不同的比例都成功復(fù)制了AS動物模型，一方面說明通過高脂高膽固醇飼喂的方法成功率高、靈活性大，另一方面也說明如何配置出更符合人類飲食特點、盡可能地節(jié)約資源、加速AS形成的相關(guān)研究欠缺。又比如在構(gòu)造動物生活環(huán)境上，在濕度、溫度等方面采用怎樣的干預(yù)措施也有待進(jìn)一步研究。同時目前也注意到，在濕熱證與AS的研究方面相對較多，構(gòu)造具有濕熱證特點的AS動物模型方法相對較多，而在陽虛與AS結(jié)合的研究則很欠缺，如何構(gòu)造具有中醫(yī)陽虛證特點的AS動物模型是今后應(yīng)該努力的方向。隨著“濕熱證”與“陽虛證”AS模型的建立，將了解不同證型AS的病理特點。并且基于兩個截然相反的證型，可進(jìn)一步探討“寒者熱之，熱者寒之”及“同病異治”的中醫(yī)特色理論的科學(xué)依據(jù)。