徐思思 倪穎勤

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031)

光感受器變性性疾病是一組以感光細(xì)胞進(jìn)行性凋亡，最終導(dǎo)致視覺功能異常甚至失明為特征的疾病，包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)等，因發(fā)病機(jī)制不同而表現(xiàn)出不同的起病時(shí)間、光感受器凋亡程度、伴隨的其他神經(jīng)癥狀等。雖然近年基因治療[1]、視網(wǎng)膜干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植[2]、視覺假體[3]等治療方式取得不斷進(jìn)展，但其臨床應(yīng)用仍受限。在患者與動(dòng)物模型中，光感受器變性往往伴隨著后續(xù)視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元顯著的形態(tài)學(xué)改變，神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能變化可能是變性過程中二級(jí)神經(jīng)元最早期的應(yīng)激反應(yīng)[4]。本文主要對(duì)RP和AMD中視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能改變做一綜述，以期為臨床治療提供新思路以及尋找更可靠的干預(yù)時(shí)間窗。

1 視網(wǎng)膜二級(jí)神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)與功能

雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞是視網(wǎng)膜信號(hào)傳遞通路中的二級(jí)神經(jīng)元，細(xì)胞核位于內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)，樹突和軸突位于外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)和內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)。該通路中主要的興奮性氨基酸為谷氨酸，抑制性氨基酸為γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和甘氨酸。根據(jù)上游的細(xì)胞不同，雙極細(xì)胞可分為視桿雙極細(xì)胞(rod bipolar cell，RBC)和視錐雙極細(xì)胞(cone bipolar cell，CBC)。根據(jù)細(xì)胞上受體不同，CBC可進(jìn)一步分為ON型和OFF型CBC。RBC和ON型CBC主要表達(dá)代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGluR)，該受體位于樹突末端[5]，被谷氨酸激活后會(huì)關(guān)閉一種非選擇性陽(yáng)離子通道TRPM1，使細(xì)胞超級(jí)化[6]。OFF型CBC主要表達(dá)離子型谷氨酸受體(ionic glutamate receptor，iGluR)，iGluR包含AMPA、kainate(KA)和NDMA3類，根據(jù)物種不同，大部分或全部OFF型CBC通過KA受體接收信號(hào)[7]，谷氨酸可激活KA/AMPA型離子通道使細(xì)胞去極化。IPL在解剖上可進(jìn)一步分為5個(gè)亞層(S1～S5)，OFF型雙極細(xì)胞軸突終止于靠外的2個(gè)亞層(S1～S2)，ON型雙極細(xì)胞軸突終止于靠?jī)?nèi)的3個(gè)亞層(S3～S5)[8]。水平細(xì)胞的樹突與軸突分別與視錐細(xì)胞、視桿細(xì)胞形成突觸，負(fù)責(zé)橫向調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜信息傳遞。

2 光感受器變性過程中二級(jí)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的改變

研究中使用的RP動(dòng)物模型超過20種，包括先天的(RCS大鼠[9-10]、rd1小鼠[11]、rd10小鼠[12-13])、轉(zhuǎn)基因的(P23H-1大鼠[14]、TgP23H豬[15])和人工誘導(dǎo)的(光照、MNU[16])。由于嚙齒類動(dòng)物視網(wǎng)膜面積小，難以模擬黃斑區(qū)局部光感受器凋亡，以及遺傳模型疾病進(jìn)展緩慢限制了AMD動(dòng)物模型的發(fā)展。近期有學(xué)者報(bào)道5XFAD小鼠模型[17]能夠較好地模擬AMD。

2.1 突觸前蛋白 眾多學(xué)者對(duì)動(dòng)物模型、RP患者、AMD患者二級(jí)神經(jīng)元突觸前膜蛋白質(zhì)，如synaptophysin[10, 14, 18]、PSD-95[10, 14]、basson[14, 19]、SV2B[18, 20]的研究顯示蛋白質(zhì)表達(dá)減少與光感受器變性程度相一致。rd10小鼠視網(wǎng)膜中synaptophysin從P5開始發(fā)生改變，遠(yuǎn)早于P10視桿細(xì)胞外節(jié)形態(tài)改變，P18光感受器數(shù)量減少[21]。除了表達(dá)量下調(diào)以外蛋白質(zhì)的位置也發(fā)生了改變，在AMD小鼠模型[22]和患者[23]中均發(fā)現(xiàn)原本位于OPL，偶爾出現(xiàn)于INL的突觸前膜蛋白質(zhì)VGLUT1、synaptophysin、CtBP2都在ONL被觀察到。

2.2 RBC樹突 RBC樹突的分化依賴于正常的光感受器信號(hào)輸入。在所有的光感受器變性模型中都觀察到了RBC樹突回縮現(xiàn)象。正常的RBC在OPL形成致密、豎直朝向ONL的樹突叢。P18的rd10小鼠發(fā)育出正常形態(tài)的RBC，從P20開始，樹突逐漸變得稀疏，開始回縮，P40時(shí)樹突幾乎完全消失[12]。相似的發(fā)現(xiàn)在MNU誘導(dǎo)變性模型[16, 24]、P23H-1轉(zhuǎn)基因大鼠[14]、TgP23H豬[15]中也有報(bào)道。在rd1快變性模型中則從未觀察到正常發(fā)育形態(tài)的樹突[25]。在RCS大鼠、DKO小鼠等慢變性模型中還可觀察到后期RBC異常出芽現(xiàn)象[19, 22]。有研究顯示在AMD患者視網(wǎng)膜中可觀察到RBC出芽，且周邊視網(wǎng)膜比中央更顯著[23]；然而也有學(xué)者報(bào)道在正常老年動(dòng)物全視網(wǎng)膜中也可觀察到RBC異常出芽現(xiàn)象[26]，具體機(jī)制未明。免疫熒光染色顯示RBC異常突起上有mGluR6表達(dá)[22, 27]。Beier等[28]對(duì)光損傷模型視網(wǎng)膜中RBC樹突方向進(jìn)行矢量求和，發(fā)現(xiàn)樹突具有指向損傷邊緣的傾向性，說明RBC在失去原來的傳入信號(hào)后主動(dòng)尋找新的上游信號(hào)。在變性后期，RBC出芽有減少的趨勢(shì)，推測(cè)當(dāng)RBC與有功能的感光細(xì)胞形成新的突觸連接以后會(huì)主動(dòng)修剪多余的突起。

2.3 RBC軸突 正常的RBC軸突筆直穿過IPL，在IPL的S5亞層形成帶有側(cè)方曲張?bào)w的終泡結(jié)構(gòu)。在rd1和rd10直至變性晚期，RBC在IPL的層次幾乎沒有受到影響[29-30]，然而RBC軸突的形態(tài)發(fā)生了改變。在rd10小鼠與P23H-1轉(zhuǎn)基因大鼠模型中，均觀察到RBC的終泡與曲張?bào)w逐漸縮小，在變性晚期階段從外型上無(wú)法與CBC軸突末梢進(jìn)行區(qū)分。但是直至變性晚期RBC軸突末梢仍存在低水平的VGluT1，提示它們可能仍有釋放谷氨酸的能力[14, 30]。

對(duì)成年rd1小鼠IPL內(nèi)與突觸傳遞有關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，synaptophysin、SV2B表達(dá)上調(diào)，且該變化在OFF亞層更顯著[20]。突觸蛋白的上調(diào)提示雙極細(xì)胞突觸活動(dòng)增強(qiáng)，可能解釋了下游的三級(jí)神經(jīng)元視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生異常的自發(fā)性放電現(xiàn)象[31]。

2.4 CBC 由于缺乏特異、敏感的標(biāo)記靶點(diǎn)，目前對(duì)CBC的研究非常有限?，F(xiàn)有研究結(jié)果存在較大差異。Zhang等[22]在DKO小鼠模型上未觀察到CBC樹突在形態(tài)上與野生型存在任何不同。Berier等[28]也報(bào)道在光損傷模型視網(wǎng)膜上CBC樹突數(shù)量與指向性未見明顯異常，但是在rd1、Aipl1-/-和rd10小鼠中均觀察到與RBC類似的樹突回縮直至消失、胞體縮小、軸突縮短的變化，速度較RBC緩慢[11-12,32-33]。Chen等[34]通過回交GUS8.4-GFP與rd1小鼠，使7型CBC表達(dá)綠色熒光蛋白，從而對(duì)其進(jìn)行觀察。雖然也發(fā)現(xiàn)了樹突回縮，但是與RBC從未發(fā)育出正常的形態(tài)不同，CBC在視錐細(xì)胞開始凋亡以后仍先發(fā)育成熟，且CBC凋亡速度和程度不呈現(xiàn)與感光細(xì)胞凋亡一致的中央-周邊模式，與視網(wǎng)膜各離心度凋亡相似。研究[35]顯示，RBC和CBC采用不同的分子機(jī)制與光感受器形成連接，綜合考慮CBC與RBC在失去上游信號(hào)后不同的變化，推測(cè)視桿、視錐通路在失去傳入后采用不同的修復(fù)方式。

2.5 水平細(xì)胞 在rd10小鼠視網(wǎng)膜中水平細(xì)胞突起從P20開始退縮，隨著變性進(jìn)展愈發(fā)顯著，最終觀察不到樹突末梢[12, 30]。在RCS大鼠和P23H-1轉(zhuǎn)基因大鼠模型中也觀察到類似現(xiàn)象[14, 19]。除了樹突退縮以外，在1月齡rd1和rd10小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)水平細(xì)胞軸突與胞體開始生出異常突起指向INL和ONL[30]，在Tg P347L兔模型和RP患者的視網(wǎng)膜上也存在這種出芽現(xiàn)象[18, 36]。有學(xué)者[22]報(bào)道這些異常突起上有mGluR6蛋白表達(dá)。當(dāng)一些在光感受器釋放遞質(zhì)過程中起重要作用蛋白的基因被敲除時(shí)(如鈣結(jié)合蛋白4[37]、鈣離子通道亞單位α1F[38])，模型上也可觀察到水平細(xì)胞出芽現(xiàn)象。由此，推測(cè)正常的突觸前膜釋放功能對(duì)維持水平細(xì)胞突起正常的分層至關(guān)重要，而在光感受器變性模型中觀察到的異常突起生成正是突觸前膜功能異常的結(jié)果。在CNGA3/CNGB雙敲除的A3B1小鼠上發(fā)現(xiàn)水平細(xì)胞早期出芽彌漫、無(wú)指向性，P28時(shí)出芽有所減少，殘余的突起在ONL內(nèi)與視桿細(xì)胞胞體形成了類似突觸的接觸，透射電鏡下具有帶狀突觸超微結(jié)構(gòu)。此時(shí)進(jìn)行微陣列分析發(fā)現(xiàn)在163個(gè)表達(dá)改變的基因中有64個(gè)與軸突導(dǎo)向信號(hào)通路有關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子Tp53、Smad、Stat3信號(hào)通路被激活[27]，但是異常突起和突觸形成的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

2.6 選擇性 早期認(rèn)為在成熟哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中，RBC與CBC的樹突分別只與視桿、視錐細(xì)胞形成突觸。后來在小鼠、猴、兔等動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)存在某種OFF型CBC直接與視桿細(xì)胞形成連接[39-40]。在正常視網(wǎng)膜中，RBC與視錐細(xì)胞的連接也偶有報(bào)道[41]。然而，在變性模型中這種異常連接的發(fā)生率大大增加，說明視網(wǎng)膜喪失了這種選擇性。早在2000年，Peng等[42]在P347L豬和rd小鼠中觀察到RBC樹突與視錐細(xì)胞之間形成了異常的突觸。使用多焦ERG和藥物分離出P347L豬外層視網(wǎng)膜與野生型不同的信號(hào)波形，可能主要來源于RBC和視錐細(xì)胞之間異常的連接[43]。這種異常的連接可能通過一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT5引發(fā)外層視網(wǎng)膜的自發(fā)電活動(dòng)[44]。但是由于這2種模型均為快變性模型，有功能的突觸要么生后很早便已丟失，要么在發(fā)育的過程中從未形成，無(wú)法推測(cè)異常突觸的形成是光感受器變性后重塑的結(jié)果。后來又有學(xué)者在RCS大鼠[32]、Rho-/-模型[45]上觀察到大量的RBC與視錐細(xì)胞形成連接現(xiàn)象，證實(shí)了錯(cuò)配是光感受器變性性疾病中普遍存在的現(xiàn)象，且在rd10小鼠上持續(xù)存在至變性晚期[30]。但是在Rho-/-、豬、貓模型上觀察到的新突觸為反折樣結(jié)構(gòu)[10, 46]，而在RCS大鼠[19]、rd10小鼠[13]上幾乎所有的突觸都為平突觸。在視網(wǎng)膜中只有視錐細(xì)胞的模型中可同時(shí)觀察到這兩種異常的突觸[47]。

在變性的光感受器主要是視錐細(xì)胞的CNGA3-/-模型上可觀察到OFF型CBC與視桿細(xì)胞形成平突觸，且突觸末梢有Glu5受體表達(dá)[45]，從多電極記錄到的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示這種異常的突觸有功能[48]。

在CNGA3-/-Rho-/-視桿、視錐都異常的模型上未觀察到上述異常突觸形成的現(xiàn)象[45]。Cao等[35]首次在分子水平上揭示了視桿細(xì)胞與RBC之間的選擇性與視桿細(xì)胞軸突末端ELFN1蛋白有關(guān)，而ELFN1蛋白的正確定位要求感光細(xì)胞具有正常的神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能。視錐細(xì)胞軸突末端可能也具有ELFN1類似蛋白起相似的作用，具體機(jī)制未明。

3 光感受器變性過程中二級(jí)神經(jīng)元突觸功能的改變

3.1 神經(jīng)遞質(zhì) 大量研究報(bào)道了光感受器變性模型雙極細(xì)胞中氨基酸水平的變化。Gibson等[49]發(fā)現(xiàn)rd1視網(wǎng)膜中谷氨酸、GABA、甘氨酸水平均有所下降。然而一項(xiàng)早期研究報(bào)道rd1視網(wǎng)膜中谷氨酸和谷氨酰胺水平較對(duì)照組升高[50]。除此以外，GABA和甘氨酸水平升高在RCS大鼠[9]中也有報(bào)道。研究結(jié)果有差異的原因，可能是使用的模型具體發(fā)病機(jī)制以及氨基酸定量方法不同。二級(jí)神經(jīng)元中氨基酸水平變化早于形態(tài)學(xué)上的改變，說明二級(jí)神經(jīng)元與光感受器間的突觸功能在變性早期即受到影響。

3.2 受體 在許多變性模型中都觀察到OPL mGluR6免疫熒光染色減低的現(xiàn)象。Borowska等[29]記錄到rd1中ON型雙極細(xì)胞靜息電位比野生型更負(fù)提示mGluR6受體下調(diào)或減敏。Chua等使用一種能夠通過開放的陽(yáng)離子通道物質(zhì)agmatine(AGB)顯示在rd1中從P15開始，ON型雙極細(xì)胞上mGluR6表達(dá)減少[51]。Dunn通過激光選擇性消融視錐細(xì)胞，觀察突觸后ON型CBC受體表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)光感受器變性對(duì)下游雙極細(xì)胞受體的影響遠(yuǎn)早于其樹突發(fā)生形態(tài)變化，大約在變性后2 h，突觸后膜上的mGluR6丟失[52]。在rd10小鼠、RCS大鼠、Aipl1-/-小鼠視網(wǎng)膜變性的進(jìn)展中，mGluR6在OPL的表達(dá)量逐漸下降，且出現(xiàn)在RBC的胞體與軸突[12, 19, 25, 53]。激活這些異位受體不能產(chǎn)生電流[13, 54]，有可能是因?yàn)槭荏w密度太低，也可能是因?yàn)樵撌荏w與下游的TRPM1通道解偶聯(lián)。

在變性的過程中，CBC上的離子型谷氨酸受體表達(dá)不變或下調(diào)。在rd10中發(fā)現(xiàn)直至變性晚期，AMPA受體(iGluR1、iGluR2、iGluR4)表達(dá)量仍然正常[13]；但是水平細(xì)胞上也有該受體表達(dá)，不能排除CBC上下調(diào)的可能性。KA受體的亞基GluK1熒光強(qiáng)度降至野生型的30%[55]。

在小鼠和兔視網(wǎng)膜中進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RBC丟失了mGluR6之后，改變了自身的谷氨酸受體，變成了OFF型雙極細(xì)胞[56]；該現(xiàn)象同樣見于RP患者[57]。正常靈長(zhǎng)類動(dòng)物視網(wǎng)膜中，ON型、OFF型CBC和RBC分別占30%、40%和30%，對(duì)RP患者視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)ON型、OFF型CBC和RBC分別占27.5%、63.5%、8.95%[56]。Jones等[36]在Tg P347L兔模型中觀察到OFF型細(xì)胞比例更高，可能是因?yàn)樵谠撃Ｐ椭幸曞F細(xì)胞大量凋亡，除了RBC以外部分ON型CBC也改變了受體。在rd1小鼠發(fā)現(xiàn)P15開始ON型CBC表達(dá)有功能的iGluR受體，但是P40后該受體消失[51]。

此外，Srivastava等[58]使用Western 印跡法對(duì)成年rd1小鼠視網(wǎng)膜各類受體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GluR1、甘氨酸受體、GABAA受體表達(dá)上調(diào)，僅有GABAC受體表達(dá)下調(diào)，GABAA受體上調(diào)與早期檢測(cè)到rd1的RBC對(duì)GABA敏感性升高相一致[54]，也可以解釋全細(xì)胞膜片鉗上記錄到的CBC產(chǎn)生自發(fā)電位的現(xiàn)象[29]。在光誘導(dǎo)變性的成年小鼠上也發(fā)現(xiàn)OPL內(nèi)GluR2亞單位表達(dá)上調(diào)，但是30 d以后下降至正常水平[59]。

3.3 電生理 視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)能記錄光感受器變性視網(wǎng)膜早期電生理的變化，其中b波的峰值和到達(dá)峰值的時(shí)間反映ON型雙極細(xì)胞突觸的功能。在動(dòng)物模型和RP患者中均記錄到隨著變性的發(fā)展b波振幅顯著降低，誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)[60-61]。rd1小鼠在任何年齡都無(wú)法記錄到視桿細(xì)胞介導(dǎo)的ERG，各種強(qiáng)度刺激下均顯示b波潛伏期延長(zhǎng)及振幅降低，且振幅下降程度較a波顯著，提示CBC與視錐細(xì)胞之間突觸傳遞障礙[11, 32]。也有學(xué)者認(rèn)為雖然b波振幅顯著降低，但a波、b波之間的回歸系數(shù)與野生型無(wú)差異，b波的異常是光感受器傳入信號(hào)減少所致，而不是二級(jí)神經(jīng)元突觸功能異常的結(jié)果[49]。Varela等[54]分離出4～8周rd1小鼠視網(wǎng)膜RBC，檢測(cè)其對(duì)谷氨酸的反應(yīng)，13個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)對(duì)谷氨酸產(chǎn)生反應(yīng)。由于在rd1小鼠視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞與RBC的突觸發(fā)育不正常，無(wú)法說明觀察到的功能缺失是由發(fā)育異常引起還是由光感受器變性造成。

在rd10小鼠視網(wǎng)膜中，視桿細(xì)胞與RBC之間突觸功能的改變，使得早在P18內(nèi)層視網(wǎng)膜尚未出現(xiàn)明顯形態(tài)改變時(shí)就可觀察到ERG b波形態(tài)與振幅的變化[62]。Puthussery等[13]使用mGluR6的激動(dòng)劑LAP-4記錄到rd10小鼠視網(wǎng)膜RBC上由mGluR6誘發(fā)的電流呈進(jìn)行性減少，P45時(shí)b波振幅較野生型下降了91%。而Barhoum等[12]觀察了P60的rd10小鼠RBC對(duì)局部施加谷氨酸的反應(yīng)，結(jié)果顯示RBC膜電位的改變幅度與野生型無(wú)顯著差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間相互矛盾可能是使用了不同的激動(dòng)劑，從而導(dǎo)致激活的受體有差異。

使用全細(xì)胞膜片鉗在P6M的rd10上記錄到OFF型CBC的電流與野生型無(wú)顯著差別[13]，提示變性晚期iGluR仍具有正常的功能。但是Marc等[57]聯(lián)合使用KA激動(dòng)劑和AGB，發(fā)現(xiàn)hrhoG小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)OFF型CBC內(nèi)無(wú)信號(hào)，說明iGluR反應(yīng)消失。雖然在一RP患者視網(wǎng)膜組織中檢測(cè)到正常的iGluR信號(hào)，但是不能排除該信號(hào)來源于異常表達(dá)iGluR的ON型細(xì)胞[57]。

4 展望

雖然目前對(duì)光感受器變性性疾病的認(rèn)知大部分來源于各類動(dòng)物模型，但來源于患者的有限研究結(jié)果表明嚙齒類動(dòng)物、兔模型確實(shí)能準(zhǔn)確地復(fù)制出患者身上從早期到晚期各階段的變性與改變。視覺信息的傳遞始于雙極細(xì)胞的樹突末梢，大量研究已證實(shí)變性性疾病早期便累及光感受器與二級(jí)神經(jīng)元之間的突觸傳遞。異常的突觸不僅影響雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞的形態(tài)與功能，還會(huì)引起內(nèi)層視網(wǎng)膜環(huán)路的改變，對(duì)視力產(chǎn)生快速、顯著的影響。任何視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)策略都不應(yīng)僅關(guān)注如何挽救視網(wǎng)膜神經(jīng)元免于死亡，確保正常的突觸結(jié)構(gòu)和功能是視覺功能恢復(fù)的關(guān)鍵。因此研究變性過程中二級(jí)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能的改變，對(duì)于后續(xù)進(jìn)行靶向干預(yù)，從而挽救視力有著積極的意義。