吳仁智，陳 東，黃 俊，陸 琦，蘆志龍，陳 英，陳小玲，黃日波*

（1.廣西科學(xué)院國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心 非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

木糖是自然界中第二豐富多聚糖—半纖維素的主要降解產(chǎn)物[1-2]，若能利用其轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，意義重大。目前已知能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的較為優(yōu)良的酵母菌種有管囊酵母（Pachysolen tannophilus）[3-4]、樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipits）[5]和休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）[6-7]等。而以樹(shù)干畢赤酵母利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力最強(qiáng)[5，8]。為此，筆者曾以樹(shù)干畢赤酵母CICC1960作為原始菌株，通過(guò)60Co誘變，選育出一株較為優(yōu)良的突變菌株1K-9[9]。而為實(shí)現(xiàn)菌株高濃度酒精發(fā)酵，需進(jìn)行高濃度糖（底物）發(fā)酵。實(shí)際上，在酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中，底物濃度會(huì)對(duì)酵母發(fā)酵的結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。若底物濃度過(guò)低，則會(huì)被酵母細(xì)胞迅速耗盡，底物供應(yīng)的不足會(huì)造成酵母細(xì)胞過(guò)早地從指數(shù)生長(zhǎng)期向平衡期轉(zhuǎn)變，發(fā)酵提前結(jié)束，乙醇濃度不高；反之，高濃度底物帶來(lái)高滲透壓，產(chǎn)生底物抑制作用，從而影響酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，生物量不足，影響發(fā)酵的進(jìn)行，造成乙醇產(chǎn)量也不高。

補(bǔ)料發(fā)酵（fedbatchfermentation）對(duì)于解決底物不足以及實(shí)現(xiàn)高濃度酒精發(fā)酵等均具有重要的意義。其一般先在一定濃度的底物下進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)過(guò)一定時(shí)期，消耗了一部分底物后，再補(bǔ)加一定濃度的底物繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，最終獲得高濃度的目標(biāo)產(chǎn)物。1987年補(bǔ)料發(fā)酵就應(yīng)用在支鏈淀粉（pullulan）生產(chǎn)上，能解決高濃度底物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的問(wèn)題從而提高支鏈淀粉的產(chǎn)量[10]。除此之外，補(bǔ)料發(fā)酵已成功應(yīng)用在丙酮-丁醇-乙醇發(fā)酵[11]、纖維素酶[12]、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶[13]、木糖醇[14]、2,3-丁二醇[15]等的生產(chǎn)。不論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模[16]，還是工業(yè)化生產(chǎn)[17]，采用補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)于酒精發(fā)酵來(lái)說(shuō)，效果均較為理想。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)首先第一輪發(fā)酵分別進(jìn)行不同濃度木糖對(duì)菌株1K-9乙醇發(fā)酵的影響試驗(yàn)，確定出一個(gè)對(duì)此菌株生長(zhǎng)、發(fā)酵較為理想的木糖濃度，然后第二輪進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵：采用含有上述較為理想濃度的木糖培養(yǎng)基進(jìn)行酒精發(fā)酵，一段時(shí)間后進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，考察酒精發(fā)酵的酒度等一系列參數(shù)，然后進(jìn)行比較，從而確定補(bǔ)料發(fā)酵是否有效，即通過(guò)探究不同濃度木糖以及補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)優(yōu)良菌株1K-9發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的影響，旨在提高木糖乙醇發(fā)酵水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

木糖（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國(guó)OXOID公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）、四水合酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、偏重亞硫酸鈉、乙腈（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌種

樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipitis）1K-9菌株：本實(shí)驗(yàn)室保存，由購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心的Pichia stipitis CICC 1960菌株經(jīng)60Co誘變選育[9]，其醪液酒精濃度比原始菌株的提高了10.05%。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸粉木糖（yeast peptone xylose，YPX）培養(yǎng)基：木糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，121℃滅菌20 min，自然pH，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基：分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%木糖培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫儀器公司；ECLIPSE80i顯微鏡（熒光）：日本尼康儀器有限公司；DU800分光光度計(jì)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；320R臺(tái)式超速離心機(jī)：德國(guó)赫提馳儀器有限公司；ZWY-240搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將甘油或斜面保存的菌株在實(shí)驗(yàn)前接種于YPX培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)接2次，同條件下培養(yǎng)菌數(shù)至2×108個(gè)/mL，4 ℃條件下保存，2 d內(nèi)使用。

1.3.2 不同濃度木糖對(duì)酵母乙醇發(fā)酵的影響

活化的菌株接種至不同木糖含量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）的發(fā)酵培養(yǎng)基，初始菌數(shù)2×108個(gè)/mL，裝液量100mL/250mL，30℃、130r/min進(jìn)行乙醇發(fā)酵，定時(shí)取樣檢測(cè)乙醇含量、殘留木糖含量、菌數(shù)等指標(biāo)。

1.3.3 補(bǔ)料發(fā)酵

同1.3.2，但先采用10%木糖培養(yǎng)基進(jìn)行木糖乙醇發(fā)酵：裝液量50 mL/250 mL，30℃、130 r/min發(fā)酵36 h時(shí)補(bǔ)加等體積20%木糖培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，定時(shí)取樣檢測(cè)乙醇含量、殘留木糖含量、菌數(shù)等指標(biāo)。

1.3.4 測(cè)定方法

菌數(shù)測(cè)定：取發(fā)酵醪液，即時(shí)進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定：樣品根據(jù)情況適當(dāng)稀釋?zhuān)醚蛴?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[18]。

乙醇含量測(cè)定：用氣相色譜法測(cè)定乙醇含量，乙腈作為內(nèi)標(biāo)，參照文獻(xiàn)[16]的方法。

木糖含量測(cè)定：取培養(yǎng)基或發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，吸取100 μL上清或上清的稀釋液后用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定，具體綜合參照美國(guó)能源部的方法[19]和GHOSE T K等[20]方法進(jìn)行（測(cè)定吸光值OD520nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基木糖含量對(duì)菌株生長(zhǎng)、乙醇產(chǎn)量及木糖利用情況的影響

酵母菌株生長(zhǎng)需要一定的培養(yǎng)條件，當(dāng)糖濃度低時(shí)，酵母細(xì)胞會(huì)快速利用完糖，而當(dāng)糖濃度過(guò)高，其面臨的滲透壓會(huì)增高，會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。為此，分別采用了含有不同濃度木糖的培養(yǎng)基對(duì)菌株1K-9進(jìn)行生長(zhǎng)及產(chǎn)乙醇情況的比較，目的是為了考察不同濃度木糖對(duì)菌株1K-9生長(zhǎng)及產(chǎn)乙醇的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1a可知，當(dāng)培養(yǎng)基木糖含量為5%～10%時(shí)，木糖含量的增加有利于酵母的生長(zhǎng)，且能快速促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)。木糖含量較低（5%）時(shí)，菌數(shù)增長(zhǎng)比較緩慢，36 h、48 h、60 h菌數(shù)分別為（6.29±0.55）×108個(gè)/mL、（8.62±1.76）×108個(gè)/mL和（9.97±0.44）×108個(gè)/mL。隨著木糖含量的增加，能快速促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)，采用10%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，36 h時(shí)菌數(shù)為（13.62±1.60）×108個(gè)/mL，且能長(zhǎng)時(shí)間維持在高菌數(shù)狀態(tài)（36～60 h），這對(duì)于酵母酒精發(fā)酵非常有利。但當(dāng)木糖含量＞10%時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出一定的抑制作用。采用15%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，36 h時(shí)菌數(shù)為（11.79±3.05）×108個(gè)/mL，比10%木糖培養(yǎng)基低。當(dāng)培養(yǎng)基木糖含量＞15%時(shí)，菌株增殖速度較低濃度時(shí)變緩，20%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h時(shí)菌數(shù)僅為（7.57±0.62）×108個(gè)/mL，需要培養(yǎng)至84 h時(shí)菌數(shù)才達(dá)到最大值（13.88±0.13）×108個(gè)/mL。當(dāng)木糖含量＞20%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制，且隨著木糖含量的增高抑制更明顯，木糖含量25%和30%培養(yǎng)36h時(shí)菌數(shù)分別只有（6.77±1.43）×108個(gè)/mL和（3.21±0.10）×108個(gè)/mL。因此，最有利于高產(chǎn)菌株1K-9生長(zhǎng)的培養(yǎng)基木糖含量為10%。

由圖1b可知，5%、10%和15%木糖培養(yǎng)基醪液的乙醇含量分別于發(fā)酵36h、48h、108h達(dá)到最大值（2.56±0.03）%vol、（4.71±0.05）%vol和（6.20±0.13）%vol。而10%木糖培養(yǎng)基相對(duì)于其他5種培養(yǎng)基，酵母最能迅速發(fā)酵生成乙醇。培養(yǎng)基木糖含量為20%時(shí)，培養(yǎng)108h醪液的乙醇含量為（4.24±0.04）%；培養(yǎng)基木糖含量為25%和30%時(shí)，發(fā)酵醪液的乙醇含量較低，最高值分別為（1.81±0.03）%和（0.79±0.07）%。

由圖1c可知，5%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵36 h時(shí)醪液中殘留木糖為（15.72±0.23）g/L，72 h利用完木糖；10%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵72 h時(shí)醪液中殘留木糖為（4.03±0.03）g/L，84 h利用完木糖；15%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵108 h時(shí)醪液中殘留木糖為（4.73±0.62）g/L；而含高濃度糖的培養(yǎng)基，20%、25%、30%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵132 h醪液中殘留木糖仍很高，分別為（48.93±1.16）g/L、（158.66±1.21）g/L和（209.47±0.43）g/L，后兩種有大量的糖殘留。利用低濃度木糖發(fā)酵，菌株能快速代謝木糖，而高濃度糖發(fā)酵，菌株受到一定的抑制造成大量的木糖殘留。酒精發(fā)酵一般要求達(dá)到一定的酒度（酒度太低，能耗高，一般采用高濃度乙醇發(fā)酵）且殘留糖含量越低越好。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖含量對(duì)菌株1K-9生長(zhǎng)（a）、乙醇產(chǎn)量（b）及木糖利用情況（c）的影響Fig.1 Effect of xylose concentration on growth(a),ethanol production(b)and xylose utilization(c)of strain 1K-9 in fermentation medium

綜合分析可知，10%木糖濃度酵母能迅速生長(zhǎng)且能維持高菌數(shù)的時(shí)間較長(zhǎng)（36～60 h）、最能迅速發(fā)酵生成乙醇。因此，最有利于菌株1K-9發(fā)酵的培養(yǎng)基木糖含量為10%。

2.2 補(bǔ)料發(fā)酵

10%木糖培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h時(shí)酵母能迅速生長(zhǎng)至一較高的菌數(shù)值。為此，菌株1K-9先采用10%木糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵，即菌株經(jīng)活化3次后，種子液以10%接種量、50 mL10%木糖培養(yǎng)基，發(fā)酵36 h補(bǔ)加等體積的20%木糖培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程菌數(shù)變化、醪液乙醇產(chǎn)量和殘?zhí)呛恳?jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中菌株1K-9生長(zhǎng)、乙醇產(chǎn)量及木糖利用情況Fig.2 Growth,ethanol production and xylose utilization of strain 1K-9 during fed-batch fermentation

由圖2可知，補(bǔ)料發(fā)酵60 h時(shí)，菌數(shù)含量達(dá)到最高值（12.62±0.27）×108個(gè)/mL，其后續(xù)的發(fā)酵菌數(shù)仍能保持較高菌數(shù)，發(fā)酵至108h時(shí)菌數(shù)也達(dá)到了（12.16±0.07）×108個(gè)/mL，較未補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)有所提高；發(fā)酵108 h時(shí)醪液中殘留的木糖含量為（1.03±0.02）g/L較未補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)有所降低；乙醇含量達(dá)到了6.56%vol，較未補(bǔ)料時(shí)提高了1.85%vol。因此，采用10%木糖培養(yǎng)基發(fā)酵36 h后立即添加20%木糖培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料繼續(xù)發(fā)酵，是十分有效的。

3 討論

補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程一般先采用低濃度底物進(jìn)行發(fā)酵，一定時(shí)期補(bǔ)加相應(yīng)濃度底物繼續(xù)發(fā)酵，既能解決菌種生長(zhǎng)的問(wèn)題，又能解決底物富足進(jìn)行發(fā)酵從而達(dá)到研究者們所期望的目標(biāo)產(chǎn)物濃度的問(wèn)題，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在發(fā)酵領(lǐng)域，并成功實(shí)現(xiàn)了諸多發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)。不論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模[16]，還是工業(yè)化生產(chǎn)[17]，采用補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)于酒精發(fā)酵來(lái)說(shuō)，效果均較為理想。曾開(kāi)展了糖蜜乙醇發(fā)酵，先采用20°Bx糖蜜培養(yǎng)酵母菌數(shù)至2×108個(gè)/mL后，補(bǔ)加等體積高糖度糖蜜（55 °Bx）繼續(xù)發(fā)酵[16]，效果顯著。此外，甘蔗糖蜜酒精高產(chǎn)酵母菌株MF1001實(shí)行高濃發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)也是類(lèi)似的方法，采用低濃度罐發(fā)酵待菌數(shù)繁殖至一定濃度（一般是2×108個(gè)/mL左右）后，再混合高濃度罐發(fā)酵，也就是低高濃度糖蜜罐混合發(fā)酵[17]。

4 結(jié)論

菌株1K-9先采用10%木糖培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇發(fā)酵，36h補(bǔ)加等體積的20%木糖培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵至108 h時(shí)菌數(shù)達(dá)到了（12.16±0.07）×108個(gè)/mL，較未補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)有所提高；發(fā)酵108h時(shí)醪液中殘留的木糖含量為（1.03±0.02）g/L，較未補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)有所降低；乙醇含量達(dá)到了6.56%vol，較未補(bǔ)料時(shí)提高了1.85%vol。為此，補(bǔ)料發(fā)酵是有效的。