尹 昕，陳 宸

（天津師范大學(xué)電子與通信工程學(xué)院，天津300387）

生物體的疾病是細(xì)胞病變和細(xì)胞失去程序性調(diào)控的綜合反應(yīng)[1].在胚胎的發(fā)育過程中，細(xì)胞在特定化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)下定向運(yùn)動(dòng)，如果未能正確控制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，將導(dǎo)致發(fā)育成的生物體產(chǎn)生嚴(yán)重的疾病或缺陷.追蹤胚胎細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡，研究其運(yùn)動(dòng)特性，進(jìn)而檢測(cè)其趨化特征，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)模式的預(yù)測(cè)和控制，將有助于醫(yī)學(xué)研究人員治療具有高度擴(kuò)散性的疾病以及進(jìn)行有針對(duì)性的藥理學(xué)研究.因此，對(duì)于胚胎細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程的實(shí)時(shí)追蹤和分析已成為當(dāng)前國際上生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，眾多學(xué)者在此方面進(jìn)行了探索.文獻(xiàn)[2-4]通過顯微圖像采集系統(tǒng)自動(dòng)捕獲雞胚胎細(xì)胞顯微圖像，采用顯微鏡的形態(tài)觀察方法觀察雞胚胎細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程和細(xì)胞簇的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)，其中多個(gè)感興趣追蹤區(qū)域間的切換由手動(dòng)完成，這種追蹤方式需要多個(gè)有實(shí)際相關(guān)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)的操作者交替工作，如果細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)變化發(fā)生在操作者交替的過程中，則相關(guān)的變化信息就無法捕捉到，因而無法實(shí)現(xiàn)長期的實(shí)時(shí)追蹤.文獻(xiàn)[5]采用基于Boyden Chamber的方法進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的自動(dòng)檢測(cè)，該方法利用染色，人工統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目來評(píng)估細(xì)胞的遷移，但無法得到動(dòng)態(tài)同步監(jiān)控細(xì)胞的顯微圖像.文獻(xiàn)[6]通過建立細(xì)胞集落劃痕的方法間接評(píng)估個(gè)體細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性，這種方法雖然操作簡單，但無法適用于胚胎細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)的追蹤研究.

綜合生物研究者的關(guān)注點(diǎn)和胚胎細(xì)胞自身的特點(diǎn)，一個(gè)比較完善的胚胎細(xì)胞追蹤與分析系統(tǒng)應(yīng)具備如下功能：首先，考慮到胚胎細(xì)胞的生理特點(diǎn)及其定向運(yùn)動(dòng)的特征，在追蹤細(xì)胞簇整體運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，應(yīng)能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)胚胎細(xì)胞單粒子的形態(tài)；其次，為了獲得細(xì)胞簇整體的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)，必須同時(shí)追蹤批量胚胎細(xì)胞；再次，考慮到胚胎細(xì)胞的活體特性，應(yīng)盡可能減少追蹤的處理時(shí)間，加強(qiáng)追蹤算法的實(shí)時(shí)性；最后，為了避免人工操作造成的誤差，上述工作應(yīng)自動(dòng)完成[7-8].然而，胚胎細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)的獲取與單粒子高分辨率細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀測(cè)是一對(duì)矛盾.在顯微視覺系統(tǒng)中，視野采集放大倍數(shù)越大，視野目標(biāo)有效圖像的分辨率越高，視野圖像分析結(jié)果越精確；但對(duì)于非均勻分布的追蹤目標(biāo)，視野放大倍數(shù)的提高將導(dǎo)致可觀測(cè)空間變小，進(jìn)而帶來較大的視野抽樣誤差.反之，如降低采樣倍率，可以減小視野抽樣誤差，但目標(biāo)的有效圖像分辨率也會(huì)同時(shí)降低，加大顯微圖像處理與分析的難度.此外，暗場顯微環(huán)境利用丁達(dá)爾光學(xué)效應(yīng)提高觀測(cè)物體本身與背景的對(duì)比，這雖然有利于觀察運(yùn)動(dòng)的物體，但無法獲取物體的細(xì)節(jié)信息[9].因此，為了獲得胚胎細(xì)胞簇精確的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)，需要在低倍暗場顯微鏡下進(jìn)行觀察；而為了得到單個(gè)胚胎細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，又必須使用高倍明場顯微鏡.

針對(duì)以上問題，本文提出基于MR-6的批量胚胎細(xì)胞的自動(dòng)追蹤算法，該算法將微操作機(jī)器人系統(tǒng)引入胚胎細(xì)胞的遷移追蹤與分析，根據(jù)顯微系統(tǒng)的光學(xué)特性，實(shí)現(xiàn)快速追蹤胚胎細(xì)胞，獲取全局信息，并實(shí)現(xiàn)胚胎細(xì)胞感興趣區(qū)域細(xì)節(jié)信息獲取的自動(dòng)化.在實(shí)驗(yàn)部分，將雞胚胎的原腸胚形成過程作為模型，利用該算法完成雞胚胎細(xì)胞遷移的自動(dòng)追蹤，并同時(shí)自動(dòng)獲取細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)及感興趣區(qū)域，以驗(yàn)證算法的有效性.

1 批量胚胎細(xì)胞的自動(dòng)追蹤算法

本研究算法流程如圖1所示.

圖1 胚胎細(xì)胞追蹤自動(dòng)化系統(tǒng)框架Fig.1 Framework of embryonic cell tracking automation system

1.1 胚胎細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)分析的自動(dòng)化

胚胎細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)的分析在低倍率物鏡下進(jìn)行，對(duì)胚胎細(xì)胞全局顯微圖像中的批量胚胎細(xì)胞進(jìn)行追蹤，獲取全局顯微圖像中批量胚胎細(xì)胞的個(gè)數(shù)及結(jié)構(gòu)分布圖，進(jìn)而得到批量胚胎細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡及運(yùn)動(dòng)速度，并形成感興趣區(qū)域.

（1）暗視場圖像采集

為了實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞的快速精確追蹤定位，需要提高胚胎細(xì)胞輪廓與背景之間的對(duì)比.在光的傳播過程中，光線照射到粒子，當(dāng)粒子尺寸小于入射光波長時(shí)，光波將環(huán)繞微粒而向其四周放射散射光.結(jié)合顯微鏡光學(xué)成像原理，使用暗視場完成對(duì)低倍率胚胎細(xì)胞全局顯微圖像的獲取.

（2）胚胎細(xì)胞遷移的追蹤策略

細(xì)胞的匹配是批量胚胎細(xì)胞遷移追蹤的關(guān)鍵，考慮到細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)具有群體性[10-11]，本文提出基于群體細(xì)胞追蹤獲取單一細(xì)胞運(yùn)動(dòng)信息的追蹤策略，該策略降低了識(shí)別的難度，同時(shí)能保證識(shí)別的正確率，其基本思想如下：

①設(shè)追蹤的任意連續(xù)2幀圖像為Ti、Ti+1，設(shè)C1為Ti中的任意一個(gè)細(xì)胞，圍繞C1在Ti和Ti+1中分別選擇一個(gè)診斷窗口wi和wi+1，對(duì)診斷窗口wi用多波段頻率特征進(jìn)行標(biāo)識(shí)，并根據(jù)標(biāo)識(shí)特征在Ti+1中定位相應(yīng)的wi+1.

②以wi+1的中心為圓心、R為半徑作一圓，則圓內(nèi)的所有細(xì)胞C1j（j=1，2，3，…，m）都是C1所要配對(duì)的候選細(xì)胞，m為候選細(xì)胞的總數(shù)目.以每一個(gè)細(xì)胞C1j為中心，取與診斷窗口wi大小相同的診斷窗口，設(shè)為wij′（j=1，2，3，…，m）.

③ 計(jì)算 2 個(gè)診斷窗口 wi與 wij′（j=1，2，3，…，m）的相關(guān)系數(shù) Cij：

其中：f和g分別為診斷窗口wi和wij′的灰度分布函數(shù)，fm和gm分別為診斷窗口wi和wij′的的灰度平均值.

④在Ti+1中取得最大相關(guān)系數(shù)值的細(xì)胞C1j被認(rèn)為與Ti中的細(xì)胞C1為同一細(xì)胞.

⑤記錄C1細(xì)胞在Ti+1中的位置信息，位置信息由下式計(jì)算

其中： i、 j為圖像像素的橫、縱坐標(biāo)位置；h（i，j）為坐標(biāo)（i，j）處的灰度值；Ω為屬于同一細(xì)胞的像素集合.

進(jìn)一步，在細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)的自動(dòng)追蹤策略中，細(xì)胞能夠正確匹配的關(guān)鍵是準(zhǔn)確標(biāo)識(shí)診斷窗口的多波段頻率特征.模擬人類視覺系統(tǒng)的并行多通道性[12-13]，利用顯微鏡的光學(xué)特性，本算法采用基于光學(xué)特性的多波段頻率特征獲取的追蹤策略，其基本思想如下：

①基于空間非相干照明的消象差成象系統(tǒng)，其光學(xué)傳遞函數(shù)的規(guī)范化傅里葉變換為

其中：fx、fy為空間頻域，xi、yi為時(shí)間域，Hi（fx，fy）為點(diǎn)脈沖強(qiáng)度，?1（fx，fy）為光學(xué)傳遞函數(shù).

設(shè)顯微系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)為Hlp（u，v），為了削弱細(xì)胞的細(xì)節(jié)成分，構(gòu)造基于光學(xué)特性的高通濾波器：

②為了避免高通濾波時(shí)，圖像的平均值降為零，進(jìn)行高通濾波補(bǔ)償，構(gòu)造高頻強(qiáng)調(diào)濾波器的傳遞函數(shù)為

其中：a為校正偏移；b為高頻突出系數(shù)，b＞1.

③設(shè)診斷窗口圖像為f（x，y），其傅里葉變換為G（u，v），則診斷窗口的多波段頻率特征為

（3）批量細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡分析與感興趣區(qū)域的確定

根據(jù)追蹤結(jié)果建立細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡并獲取細(xì)胞運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)模型的參數(shù).設(shè)細(xì)胞位置為{（x1，y1），（x2，y2），…，（xn，yn）}，則第i個(gè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)方向和曲率分別為

根據(jù)多波段頻率特征的獲取方法來統(tǒng)計(jì)頻率特征的能量分布，以確定感興趣區(qū)域.

1.2 胚胎細(xì)胞遷移中感興趣區(qū)域細(xì)節(jié)信息的自動(dòng)化獲取

本系統(tǒng)根據(jù)顯微鏡齊焦合軸的特點(diǎn)在明視場下實(shí)現(xiàn)了低倍率物鏡[14-16]下顯微圖像感興趣區(qū)域細(xì)節(jié)信息的自動(dòng)獲取.顯微圖像感興趣區(qū)域細(xì)節(jié)信息的自動(dòng)獲取策略如下：

首先根據(jù)顯微圖像的恒定窗口（1 024×768像素），得出中心點(diǎn)的像素空間坐標(biāo)（512×384）.在低倍鏡下選擇感興趣區(qū)域，利用所選區(qū)域的左下角點(diǎn)的坐標(biāo)A（x1，y1），求得其與中心點(diǎn)坐標(biāo)之差（512-x1，384-y1）.在4倍物鏡下測(cè)量得每個(gè)像素大約為2.996μm，因此中心點(diǎn)到所選區(qū)域左下角點(diǎn)的x、y方向的距離為XA=2.996（512-x1），YA=2.996（384-y1）.

根據(jù)距離不變?cè)瓌t，當(dāng)換用高倍物鏡時(shí)，微操作平臺(tái)可以根據(jù)所選區(qū)域左下角到中心點(diǎn)的x、y方向的距離進(jìn)行相應(yīng)的移動(dòng)，從而將4倍物鏡下的左下角點(diǎn)移到高倍物鏡下的中心點(diǎn)上.然后再根據(jù)所選區(qū)域右下角點(diǎn)的坐標(biāo)C（x2，y2）計(jì)算C點(diǎn)和A點(diǎn)之間x、y方向的距離： XAC=2.996（x2-x1），YAC=2.996（y2-y1），C點(diǎn)和A點(diǎn)在x、y方向的距離即為所選區(qū)域的寬和高，根據(jù)寬和高可計(jì)算出在高倍物鏡下，x、y方向的掃描范圍為Sx=XAC/s，Sy=YAC/s，從而實(shí)現(xiàn)高倍物鏡下感興趣區(qū)域的自動(dòng)定位，其中s為電動(dòng)載物平臺(tái)每次移動(dòng)的距離.

2 自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)研究

實(shí)驗(yàn)采用MR-6微操作機(jī)器人系統(tǒng)平臺(tái)，該系統(tǒng)機(jī)械手臂的運(yùn)動(dòng)范圍為2 cm×2 cm×2 cm，電動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)范圍為10 cm×10 cm，在保證平穩(wěn)運(yùn)動(dòng)的前提下，運(yùn)動(dòng)速度的范圍為0.75～1500μm/s，運(yùn)動(dòng)精度可達(dá)1μm，同時(shí)，該系統(tǒng)還具有自動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換與自動(dòng)調(diào)焦功能.

雞因其獨(dú)特的生物學(xué)特性成為許多問題研究的重要模式生物，雞的胚胎發(fā)育可以為人類和其他模式生物研究提供許多啟示.自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)中以雞胚胎的原腸胚形成作為研究模型，將追蹤胚胎細(xì)胞遷移的自動(dòng)化追蹤方法應(yīng)用于雞胚胎細(xì)胞的遷移追蹤實(shí)驗(yàn)中.考慮到細(xì)胞移動(dòng)特性[2]，利用微操作機(jī)器人系統(tǒng)每隔20 ms采集一幀雞胚胎細(xì)胞圖像并進(jìn)行追蹤分析，獲取雞胚胎細(xì)胞遷移的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù).

在4倍物鏡下經(jīng)調(diào)焦得到點(diǎn)光源的衍射圖像，即點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，如圖2所示.

圖2 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)Fig.2 Point spread function

在暗視場下采集到的細(xì)胞圖像具有背景黑色、輪廓信息突出的特點(diǎn)，與明場顯微圖像相比，暗視場顯微圖像削弱了背景的干擾信息，使目標(biāo)信息更加清晰，有利于觀察細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程.暗視場下的雞胚胎顯微圖像示例見圖3.

圖3 暗視場下的雞胚胎顯微圖像Fig.3 Microscopic image of chicken embryos under dark field

利用上述算法追蹤圖像序列中從第2幀（Timelapse GFPeggs R005_3-0002.tif，標(biāo)號(hào) 02）到第21幀（Time-lapse GFPeggs R005_3-0021.tif，標(biāo)號(hào)21）的41個(gè)細(xì)胞，其中部分顯微圖像見圖4.

圖4 追蹤的顯微圖像序列示例Fig.4 Examples of tracking microscopic image sequence

多細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5.圖5中，粉色標(biāo)識(shí)塊代表每個(gè)被追蹤細(xì)胞的開始位置，藍(lán)色路徑形成了每個(gè)被追蹤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡.

圖5 雞胚胎細(xì)胞圖像序列中的多細(xì)胞追蹤Fig.5 Multicell tracking in chicken embryonic cell image sequence

以圖5中某個(gè)被追蹤細(xì)胞為例，表1給出了圖像序列中該細(xì)胞的位置信息，圖6為該細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡.

表1 被追蹤圖像序列中特定細(xì)胞的位置信息Tab.1 Location information of a specific cell in a tracking image sequence

圖6 被追蹤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡Fig.6 Trajectories of the tracked cell

由圖5和圖6可見，本算法能夠在圖像采集間隔20 ms內(nèi)完成追蹤分析任務(wù)，在雞胚胎細(xì)胞顯微圖像序列中自動(dòng)追蹤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡，獲取運(yùn)動(dòng)細(xì)胞整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)，驗(yàn)證了算法的有效性.

3 結(jié)語

將微操作機(jī)器人系統(tǒng)引入胚胎細(xì)胞的遷移追蹤與分析研究，在MR-6型微操作機(jī)器人系統(tǒng)平臺(tái)上，根據(jù)顯微鏡成像原理，基于顯微系統(tǒng)的光學(xué)特性，提出批量胚胎細(xì)胞的自動(dòng)追蹤算法，解決了整體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)追蹤與微細(xì)結(jié)構(gòu)觀測(cè)的矛盾，并通過自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了胚胎細(xì)胞遷移追蹤的自動(dòng)化.本文算法對(duì)于虛擬細(xì)胞建模具有重要意義，可用于以微生物為載體的運(yùn)輸機(jī)制、微細(xì)胞的分割技術(shù)和高速運(yùn)動(dòng)追蹤等研究，在生物醫(yī)學(xué)以及微機(jī)電系統(tǒng)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.