余曉軍,陳雪松,徐永清,王曉鳳,吉 麗,劉 亞

(1.中國(guó)人民解放軍第五十九中心醫(yī)院創(chuàng)傷顯微外科,云南開遠(yuǎn) 661699;2.中國(guó)人民解放軍昆明總醫(yī)院全軍骨科中心,昆明 650000)

臨床及基礎(chǔ)研究證明，重建皮瓣感覺(jué)具有重要意義[1-3]，可明顯減少破潰及感染等遠(yuǎn)期并發(fā)癥，增加皮瓣耐磨性[4]。因其與未重建感覺(jué)皮瓣相比，除了通過(guò)外周途徑機(jī)制，還通過(guò)中央途徑機(jī)制恢復(fù)皮瓣感覺(jué)[5]。目前臨床中重建皮瓣感覺(jué)方法有神經(jīng)植入法及神經(jīng)吻合法，后者其實(shí)為順行吻合皮瓣原近端皮神經(jīng)重建皮瓣感覺(jué)的方法，因?yàn)樯儆心嫘形呛掀ぐ赀h(yuǎn)端皮神經(jīng)重建皮瓣感覺(jué)的報(bào)道。隨著顯微外科的發(fā)展及“追求正?！钡睦砟畹耐茝V，很多皮瓣，如游離的遠(yuǎn)端蒂的小腿后外側(cè)皮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣等，難以采用順行吻合神經(jīng)法重建皮瓣感覺(jué)，而逆行吻合神經(jīng)法則很容易。但其能否像前者一樣恢復(fù)皮瓣良好感覺(jué)？為此，本研究建立了該重建皮瓣感覺(jué)方法的動(dòng)物模型，并利用抗NF抗體免疫組化法，在光鏡下觀察皮瓣感覺(jué)神經(jīng)末梢再生情況，從組織形態(tài)學(xué)上觀察該方法的療效，為進(jìn)一步推廣臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

健康豚鼠100只，雌雄不限，體質(zhì)量為280～320 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。苯巴比妥鈉(福建省閩東九捷迅藥業(yè)有限公司)；4%多聚甲醛(蘇州澤科生物技術(shù)有限公司)；蔗糖(Sigma公司，美國(guó))；明膠(東莞市新成明膠有限公司)；0.01 mmol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；TritonX-100溶液(Sigma公司，美國(guó))；抗神經(jīng)絲鼠單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)； 抗鼠抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；卵白素溶液(Sigma公司，美國(guó))； DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。顯微器械(寧波市成和顯微器械廠)；顯微鏡(寧波市成和顯微器械廠)；冰凍切片機(jī)Leica1950(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)；載玻片(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；冰箱(青島海爾集團(tuán)公司)；光學(xué)顯微鏡(上海富萊光學(xué)科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將100只豚鼠按手術(shù)時(shí)對(duì)皮瓣神經(jīng)處理方式，分為A組(逆行吻合神經(jīng)組)、B組(順行吻合神經(jīng)組)、C組(無(wú)神經(jīng)組)、D組(正常組)4組，A、B、C組各隨機(jī)挑選30只豚鼠，D組10只。A組采用逆行吻合皮瓣內(nèi)神經(jīng)重建皮瓣感覺(jué)；B組采用順行吻合皮瓣內(nèi)神經(jīng)重建皮瓣感覺(jué)；C組切除皮瓣近端長(zhǎng)約1.5 cm神經(jīng)；D組直接切取皮瓣行抗神經(jīng)絲抗體免疫組織化學(xué)法檢查。

1.2.2皮瓣設(shè)計(jì)與制作 用苯巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉成功后，剔除豚鼠乳頭以遠(yuǎn)左后肢毛發(fā)，聚維酮碘消毒，鋪無(wú)菌巾。以后肢內(nèi)側(cè)中點(diǎn)為蒂部，隱神經(jīng)走形為軸線，設(shè)計(jì)一大小約2.0 cm×2.0 cm隱神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣(圖1A)。按設(shè)計(jì)線切開皮膚，從四周向軸線及蒂部深筋膜層切取皮瓣，顯微鏡下分離，勿損傷隱神經(jīng)伴行動(dòng)靜脈穿向皮瓣內(nèi)的分支，最后皮瓣僅與近端蒂部相連。A組在皮瓣以遠(yuǎn)的軸線上，做一長(zhǎng)約2.2 cm切口，游離出隱神經(jīng)及伴行血管2.2 cm,在其遠(yuǎn)端離斷，血管用9-0顯微縫合線予以結(jié)扎。然后在蒂部游離出隱神經(jīng)，予以離斷，將遠(yuǎn)端隱神經(jīng)旋轉(zhuǎn)180度，通過(guò)皮瓣與蒂部隱神經(jīng)近端用10-0顯微縫合線，端端吻合(圖1B、C)。皮瓣遠(yuǎn)側(cè)端所帶神經(jīng)與受區(qū)神經(jīng)吻合的方式稱為逆行吻合。B組皮瓣在蒂部游離出隱神經(jīng)，并予以離斷，然后用10-0顯微縫合線，端端吻合(圖1D、E)。皮瓣近側(cè)端所帶神經(jīng)與受區(qū)神經(jīng)吻合的方式稱為順行吻合。C組皮瓣在蒂部游離出一長(zhǎng)約1.5 cm隱神經(jīng)，并予以切除(圖1F、G)。D組為直接切取皮瓣行免疫組化檢查。為避免術(shù)后吻合神經(jīng)端端裂開，A、B組用石膏固定術(shù)肢。術(shù)后3 d，每天腹腔注射一次青霉素(10萬(wàn)U)預(yù)防感染治療。為避免外周途徑的長(zhǎng)入，分別在術(shù)后第1、2、3個(gè)月末前2周，在A、B、C組各選取10只豚鼠，消毒鋪單，將A、B、C組皮瓣沿原切口切開至肌層后，縫合切口(圖1H、I、J)。術(shù)后處理同前。然后在術(shù)后第1、2、3個(gè)月末，將各組皮瓣原位游離，行抗神經(jīng)絲抗體免疫組織化學(xué)檢查。

A：皮瓣設(shè)計(jì);B、C：A組方法;D、E：B組方法;F、G：C組方法；H、I、J：將愈合良好的A、B、C組皮瓣沿原切口切開至肌層后，縫合切口；黃色箭頭：神經(jīng)吻合處

圖1實(shí)驗(yàn)中所用手術(shù)方法

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

A～C：A組、B組及C組1個(gè)月時(shí)神經(jīng)再生情況；D～F：D組神經(jīng)分布情況；G～L：A組、B組及C組2個(gè)月時(shí)神經(jīng)再生情況；M～R：A組、B組及C組3個(gè)月時(shí)神經(jīng)再生情況；藍(lán)色箭頭：神經(jīng)干內(nèi)再生神經(jīng)；綠色箭頭：真皮層形成的神經(jīng)網(wǎng)叢；紅色箭頭：毛囊感受器；黃色箭頭：表皮層內(nèi)形成的游離神經(jīng)末梢

圖2各組感覺(jué)末梢術(shù)后1、2、3個(gè)月形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

1.3.1大體觀察 麻醉后保暖，觀察呼吸及蘇醒狀況。手術(shù)后觀察豚鼠精神及飲食情況，觀察固定肢體石膏是否松動(dòng)，皮瓣循環(huán)是否良好，縫合口是否出現(xiàn)感染等征象。

1.3.2感覺(jué)末梢形態(tài)學(xué)觀察 有毛動(dòng)物肢體皮瓣感覺(jué)恢復(fù)的客觀指標(biāo)，主要取決于游離神經(jīng)末梢與毛囊感受器(超微結(jié)構(gòu))再生的數(shù)量，與數(shù)量成正比。在觀察有毛動(dòng)物皮膚超微結(jié)構(gòu)的方法中，主要有免疫組化法和改良Biedschowsky銀染法，本研究選擇抗神經(jīng)絲抗體免疫組化法+光鏡觀察豚鼠各種重建感覺(jué)方法的皮瓣的感覺(jué)末梢形態(tài)學(xué)觀察。具體方法步驟如下：(1)離體皮瓣立即放入4%多聚甲醛中固定12 h(4 ℃)；(2)侵入20%蔗糖溶液8～12 h脫水處理(4 ℃)；(3)樣本做50微米厚冰凍切片，并保持每個(gè)樣本切取量的總長(zhǎng)度為200 mm,載玻片預(yù)先用1∶100的明膠液做防脫片處理；(4)0.01 mmol/L PBS液簡(jiǎn)洗切片；為增加膜通透性，室溫下0.3% TritonX-100溶液孵育0.5 h；(5)用1∶4 000抗NF單克隆抗體4 ℃孵育3 d；(6)1∶150抗鼠抗體室溫6 h；(7)用DAB加強(qiáng)染色法顯色；(8)光鏡下觀察感覺(jué)末梢再生情況，陽(yáng)性神經(jīng)纖維呈藏藍(lán)色束狀或絲狀結(jié)構(gòu)，背景呈淡棕色或棕色。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察情況

所有豚鼠麻醉后經(jīng)保暖，均順利蘇醒，術(shù)后第2日正常飲食，精神狀況好，所有豚鼠均成活。C組1只豚鼠皮瓣發(fā)生完全壞死，考慮無(wú)穿支血管進(jìn)入皮瓣所致；B組1只豚鼠皮瓣發(fā)生感染，周緣出現(xiàn)壞死；其余豚鼠皮瓣均成活，未發(fā)生感染及壞死。A、B組豚鼠石膏未出現(xiàn)松動(dòng)斷裂，固定有效。

2.2 光鏡下各組皮瓣內(nèi)感覺(jué)末梢形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1術(shù)后1個(gè)月 A組：逆行吻合神經(jīng)反折段已有神經(jīng)纖維再生，但未達(dá)到皮瓣內(nèi)原有神經(jīng)近側(cè)端，皮瓣內(nèi)神經(jīng)末梢潰變，神經(jīng)周圍未見神經(jīng)再生現(xiàn)象(圖2A)。 B組：皮瓣內(nèi)原有新生神經(jīng)纖維長(zhǎng)入，神經(jīng)周圍未見顯著神經(jīng)再生現(xiàn)象，表皮內(nèi)未見游離神經(jīng)末梢及毛囊感受器形成(圖2B)。 C組：皮瓣原有神經(jīng)纖維及神經(jīng)末梢部分潰變，無(wú)再生神經(jīng)纖維形成，神經(jīng)末梢密度較正常降低(圖2C)。D組：皮瓣神經(jīng)干內(nèi)神經(jīng)纖維分布均勻，皮瓣真皮層可見大量神經(jīng)網(wǎng)叢，表皮層可見游離神經(jīng)末梢及毛囊感受器存在(圖2D、E、F)。

2.2.2術(shù)后2個(gè)月 A組：皮瓣內(nèi)原有及反折段神經(jīng)均有新生神經(jīng)纖維長(zhǎng)入，密度較正常稍低，并以神經(jīng)為中心，真皮層可見神經(jīng)網(wǎng)叢，表皮下可見游離神經(jīng)末梢，密度未達(dá)正常，皮瓣周緣未見神經(jīng)再生現(xiàn)象(圖2G、H)。 B組：皮瓣內(nèi)原有新生神經(jīng)纖維密度較術(shù)后1個(gè)月時(shí)明顯增加，神經(jīng)周圍真皮層神經(jīng)網(wǎng)叢形成，表皮可見游離神經(jīng)末梢，密度未達(dá)正常，皮瓣周緣未見神經(jīng)再生現(xiàn)象(圖2I、J)。C組：皮瓣原有神經(jīng)纖維及神經(jīng)末梢完全潰變，無(wú)再生神經(jīng)纖維形成，神經(jīng)末梢密度較正常明顯降低(圖2K、L)。

2.2.3術(shù)后3個(gè)月 A組：皮瓣內(nèi)原有及反折段神經(jīng)新生神經(jīng)纖維完全長(zhǎng)入，橫切面神經(jīng)纖維密度接近正常，除神經(jīng)周圍外，皮瓣周緣真皮層可見神經(jīng)網(wǎng)叢，表皮下可見游離神經(jīng)末梢及毛囊感受器，密度與正常相仿(圖2M、N)。B組：皮瓣內(nèi)原有新生神經(jīng)纖維密度接近正常，皮瓣周圍亦可見真皮層神經(jīng)網(wǎng)叢形成，表皮可見游離神經(jīng)末梢及毛囊感受器，密度與正常相仿(圖2 O、P)。C組：皮瓣原有神經(jīng)纖維及神經(jīng)末梢完全潰變，無(wú)新生神經(jīng)纖維再生，神經(jīng)末梢密度極低，與其他組結(jié)果有明顯區(qū)別(圖2Q、R)。

3 討 論

3.1 建模背景

2001年柴益民等[6]將穿支皮瓣與皮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣原理結(jié)合，提出了動(dòng)脈穿支蒂皮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣的概念。該類皮瓣質(zhì)地適中，不損傷主干血管，皮瓣內(nèi)所帶皮神經(jīng)為重建感覺(jué)創(chuàng)造條件。臨床中在修復(fù)感覺(jué)恢復(fù)要求高的手足部創(chuàng)面時(shí)得到大量運(yùn)用[7-13]。本研究采用腓動(dòng)脈穿支蒂小腿后外側(cè)皮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣游離移植修復(fù)手足部創(chuàng)面時(shí)，為更能遵循“受區(qū)修復(fù)重建好，供區(qū)破壞損失少，成活可靠，操作簡(jiǎn)單易行”的皮瓣設(shè)計(jì)原則，本研究多選擇小腿中下段穿支，并向近端設(shè)計(jì)皮瓣，爭(zhēng)取供區(qū)直接縫合或少植皮，減少供區(qū)植皮的并發(fā)癥。此時(shí)，要重建皮瓣感覺(jué)，因皮瓣近端皮神經(jīng)與穿支血管方向相反，距離遠(yuǎn)，不利于順行吻合，臨床中，選擇了逆行吻合法，通過(guò)隨訪，亦取得了良好療效。但查閱文獻(xiàn)，缺乏逆行吻合神經(jīng)法重建皮瓣感覺(jué)的基礎(chǔ)研究方面的證據(jù)。

3.2 臨床意義

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立逆行吻合神經(jīng)組、順行吻合神經(jīng)組、不吻合神經(jīng)組及正常皮膚組的動(dòng)物模型，再采用抗神經(jīng)絲抗體免疫組化法，光鏡下比較各組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)采用逆行吻合神經(jīng)法與順行吻合神經(jīng)法重建皮瓣感覺(jué)，最終均能形成與人類皮膚感覺(jué)神經(jīng)末梢相似的游離末梢及毛囊感受器，皮瓣有效重建感覺(jué)，并以中央途徑的機(jī)制恢復(fù)；(2)實(shí)驗(yàn)中排除外周途徑機(jī)制恢復(fù)感覺(jué)的影響后發(fā)現(xiàn)，不管是通過(guò)逆行吻合神經(jīng)法還是順行吻合神經(jīng)法，重建皮瓣感覺(jué)的效果均優(yōu)于不吻合神經(jīng)的皮瓣感覺(jué)恢復(fù)效果。證明了逆行吻合神經(jīng)法重建皮瓣感覺(jué)的可行性，彌補(bǔ)了基礎(chǔ)研究的理論基礎(chǔ)，可為后期進(jìn)行相關(guān)研究提供理論依據(jù)。更重要的是，為臨床應(yīng)用提供了指導(dǎo)意見:本實(shí)驗(yàn)表明，神經(jīng)纖維不像肢體粗大淺靜脈，存在某種阻礙逆行傳導(dǎo)的因素，而像電線，不管從那端通電，都可以傳輸軸漿流，到達(dá)終末感受器，形成有效感覺(jué)。因此對(duì)于臨床中需重建感覺(jué)的皮瓣，如臨床使用較多的蒂部設(shè)計(jì)在皮瓣遠(yuǎn)端的腓動(dòng)脈穿支小腿后外側(cè)皮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣，因解剖原因及美觀要求，難以采用順行吻合神經(jīng)法重建皮瓣感覺(jué)，有上述結(jié)論，可以果斷選擇逆行吻合神經(jīng)法重建皮瓣感覺(jué)，去避開解剖限制及達(dá)到美觀要求。臨床中，經(jīng)常遇到受區(qū)所需皮瓣修復(fù)的面積大，通過(guò)單一吻合神經(jīng)難以讓皮瓣所有區(qū)域獲得感覺(jué)恢復(fù)，為減少術(shù)后并發(fā)癥，應(yīng)將皮瓣內(nèi)皮神經(jīng)走形部分設(shè)計(jì)在關(guān)鍵區(qū)，如易受壓及受摩擦的區(qū)域；為盡量擴(kuò)大感覺(jué)恢復(fù)面積，應(yīng)將皮瓣內(nèi)皮神經(jīng)走形部分設(shè)計(jì)在受區(qū)缺乏神經(jīng)分布的區(qū)域，離皮神經(jīng)支配部位較遠(yuǎn)的皮瓣部分設(shè)計(jì)在神經(jīng)分布豐富的區(qū)域。對(duì)于臨床中皮瓣難通過(guò)外周途徑機(jī)制獲得感覺(jué)，如皮瓣較大較厚，創(chuàng)基缺乏神經(jīng)[14]，而受區(qū)又需較好感覺(jué)恢復(fù)情況下，選擇逆行或順行吻合皮瓣內(nèi)神經(jīng)至關(guān)重要，應(yīng)作為術(shù)前計(jì)劃的重要部分。

3.3 建模要點(diǎn)

(1)選擇建模動(dòng)物時(shí)，應(yīng)以性情溫和，便于術(shù)后觀察皮瓣，神經(jīng)有合適直徑，便于術(shù)中吻合，保證手術(shù)效果為原則。豚鼠滿足上訴條件，且價(jià)格適中，所以我們選擇其為建模動(dòng)物，大白鼠及小白鼠因性情差及個(gè)體小而不適合。(2)切取豚鼠隱神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管皮瓣時(shí)，術(shù)中探查見后肢上1/2段隱神經(jīng)伴行血管穿支少或缺如，設(shè)計(jì)皮瓣時(shí)蒂部應(yīng)該選擇在后肢中段以遠(yuǎn)，以確保皮瓣循環(huán)。(3)豚鼠行走過(guò)程中，隨著關(guān)節(jié)的位移，神經(jīng)吻合口可能發(fā)生斷裂，影響手術(shù)療效，因此，固定術(shù)肢關(guān)節(jié)對(duì)確保手術(shù)效果至關(guān)重要。(4)切取樣本行抗神經(jīng)絲抗體免疫組化法檢查前2周，切開原皮瓣周緣具有必要性，因?yàn)閷?duì)于豚鼠厚度較薄面積較小的皮瓣，本身通過(guò)外周途徑亦可恢復(fù)良好感覺(jué)恢復(fù)[15]。術(shù)前2周切開皮緣，可減少外周途徑產(chǎn)生的影響。

3.4 存在不足

本實(shí)驗(yàn)僅做到定性分析，未行定量及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無(wú)法確定逆行吻合法與順行吻合法孰優(yōu)孰劣，無(wú)法確定它們重建的結(jié)果與正常皮膚的差異大小。且神經(jīng)末梢形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)方法單一，降低了可信度。下一步，將采用多種對(duì)神經(jīng)末梢形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)方法，并增加對(duì)其功能性的研究，定量分析其可行性。