周 娟，鐘詢龍，黃素超，鄭宏明，盧琳琳

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510260；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510006)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，以順鉑(DDP)為代表的鉑類聯(lián)合其他化療藥是臨床治療肺癌的一線方案[1]，多數(shù)患者在化療初期對(duì)藥物敏感，表現(xiàn)為腫瘤體積縮小，臨床癥狀明顯減輕，但后期效果不佳，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性是導(dǎo)致肺癌化療失敗的主要原因之一[2]。因此，臨床迫切需要能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的藥物。

紫草為紫草科植物新疆紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，是我國(guó)常用中藥材，味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有清熱涼血，活血解毒，透疹消斑等功效[3]。紫草素(Shikonin，SHK) 是一種萘醌類化合物，為紫草的主要有效成分之一，紫草素具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、加速傷口愈合和增強(qiáng)免疫等功效[4]。目前，紫草素的抗腫瘤作用是研究的熱點(diǎn)，紫草素可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用[5]。研究表明紫草素可以顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7]，但紫草素對(duì)肺癌順鉑耐藥的影響報(bào)道相對(duì)較少，本研究通過體內(nèi)體外兩方面考察紫草素對(duì)人肺腺癌順鉑耐藥的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

A549細(xì)胞、A549/DDP來源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。SPF級(jí)BALB/c-nude雌性小鼠(46周，16～20 g)，購(gòu)買于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0029]，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK (GZ) 2014-0144]。

1.2 儀器與試劑

紫草素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度大于或等于98%；順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥；環(huán)磷酰胺、MTT、玉米油購(gòu)自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) A549、A549/DDP細(xì)胞用含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基。

1.3.2MTT法檢測(cè)紫草素對(duì)A549、A549/DDP細(xì)胞毒性影響

1.3.2.1細(xì)胞準(zhǔn)備 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化、離心、加培養(yǎng)基混勻，按每孔2 000個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞接種到96孔板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)后，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2設(shè)計(jì)藥物濃度 紫草素按0、1、2、4、6 μmol/L設(shè)定給藥濃度。

1.3.2.3給藥處理 移除原有培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定藥物濃度，每孔加入200 μL含藥完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3.2.4細(xì)胞毒性檢測(cè) 給藥結(jié)束后棄除培養(yǎng)基，加入用PBS配制的MTT溶液(0.5 mg/mL)，每孔100 μL，37 ℃恒溫避光孵育4 h；接著棄去MTT溶液，加入DMSO(每孔150 μL)，置微孔板振蕩器上快速振蕩10 min、混勻，隨后把96孔板置于多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)其吸光度OD值(測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm)。

1.3.2.5檢測(cè)得到的OD值，使用軟件GraphPad Prism5 制作生長(zhǎng)抑制曲線，并計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.3.3裸鼠異種移植瘤模型的建立

1.3.3.1動(dòng)物處理及飼養(yǎng) BALB/c-nude小鼠購(gòu)回后，先在飼養(yǎng)的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)環(huán)境1周后，開始移植瘤模型的構(gòu)建。

1.3.3.2腫瘤細(xì)胞的移植 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549/DDP細(xì)胞消化后，用無血清的1640培養(yǎng)基混懸，并用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，混懸細(xì)胞，按3.0×106/只將混懸好的細(xì)胞注射到裸鼠的右前肢腋下。

1.3.3.3接瘤后觀察指標(biāo) 腫瘤細(xì)胞移植后，每天觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)的情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小[腫瘤體積的計(jì)算公式：TV (mm3)=(L×W2)/2]，同時(shí)記錄下裸鼠的體質(zhì)量，并觀察其精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食和大小便情況等。

1.3.4紫草素對(duì)A549/DDP裸鼠異種移植瘤的影響

1.3.4.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥 待腫瘤體積均達(dá)到50～100 mm3時(shí)，將裸鼠按照腫瘤體積和體質(zhì)量分為5組：玉米油空白對(duì)照組(control)、環(huán)磷酰胺25 mg/kg陽性對(duì)照組(CTX)，順鉑2 mg/kg組(DDP)、紫草素2 mg/kg組(SHK)、順鉑2 mg/kg+紫草素2 mg/kg混合組(DDP+SHK)，每組8只。根據(jù)前期紫草素在體內(nèi)抗肺腺癌藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]，給藥方案予每天1次，按上述劑量連續(xù)23 d腹腔注射相應(yīng)藥物。

1.3.4.2給藥期間檢測(cè)指標(biāo) 觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，并同時(shí)使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，記錄下裸鼠的體質(zhì)量和腫瘤體積大小(3天/次)，并觀察其精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食和大小便的情況。

1.3.4.3評(píng)價(jià)指標(biāo) 結(jié)束23 d的給藥后，解剖小鼠，分離取出腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等主要器官，并分別進(jìn)行稱重、樣品保存。

1.3.5A549對(duì)順鉑及紫草素的耐藥指數(shù)評(píng)價(jià)

1.3.5.1細(xì)胞準(zhǔn)備 A549細(xì)胞接種于75 flask，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.2藥物處理 移除原有培養(yǎng)基，分別加入含順鉑 (5 μmol/L) 或紫草素 (2 μmol/L)完整培養(yǎng)基各10 mL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.5.3耐藥培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)至75 flask約80%時(shí)，胰酶消化，使用正常完全培養(yǎng)基按1∶3傳代。重復(fù)上述步驟，使A549分別反復(fù)長(zhǎng)期暴露于含順鉑 (5 μmol/L) 或紫草素 (2 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，以獲得A549順鉑耐藥株或A549紫草素耐藥株。

1.3.5.4耐藥性評(píng)價(jià) 分別于長(zhǎng)期藥物暴露的第0、5、16、20代，使用MTT法，檢測(cè)順鉑(0、2、4、6、8、10、20 μmol/L)和紫草素(0、1、2、4、6、8 μmol/L)對(duì)細(xì)胞株活力影響。使用軟件Graph Pad Prism5計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度IC50值。利用耐藥指數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞耐藥性：耐藥指數(shù)(RI)= IC50(第X代)/IC50(第0代)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1紫草素對(duì)人肺腺癌A549/DDP耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

紫草素分別干預(yù)A549細(xì)胞、A549/DDP耐藥細(xì)胞，MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞IC50值為2.27 μmol/L，A549/DDP耐藥細(xì)胞株的IC50為0.95 μmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A549順鉑耐藥株對(duì)紫草素不具有耐受性，相反，紫草素對(duì)A549順鉑耐藥細(xì)胞具有更高的殺傷效力，見圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)紫草素對(duì)A549細(xì)胞、A549/DDP耐藥細(xì)胞的細(xì)胞活力

2.2 紫草素對(duì)A549/DDP裸鼠異種移植瘤的抑制作用

建立A549/DDP順鉑耐藥移植瘤裸鼠模型，按“1.3.4”項(xiàng)下方法分5組考察紫草素 (SHK,2 mg/kg) 對(duì)耐順鉑A549細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)抑制率。與對(duì)照組相比，給藥期間小鼠的體質(zhì)量無明顯變化，且各組差異不大 (圖2A)。與對(duì)照組相比，DDP、SHK、DDP+SHK以及25 mg/kg CTX組均可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，腫瘤體積及重量如圖2B、圖2C)，其中，紫草素可有效阻滯A549/DDP耐藥細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng) (抑瘤率35.91%，P<0.05)，且與順鉑聯(lián)合給藥時(shí)，更能顯著增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性(聯(lián)合組抑瘤率46.19%vs.順鉑給藥組抑瘤率13.98%，P<0.01)。解剖各組小鼠取常規(guī)臟器心、肝、脾、肺、腎，檢測(cè)臟器指數(shù)，結(jié)果顯示各組臟器指數(shù)無明顯差異(圖3)。

2.3 紫草素耐藥指數(shù)評(píng)價(jià)

在上述試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)紫草素對(duì)于A549/DDP 的敏感性較單純的A549更高，在體內(nèi)可抑制耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)，且在體內(nèi)與順鉑聯(lián)合給藥時(shí)，更能顯著增加A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但長(zhǎng)期使用紫草素是否會(huì)產(chǎn)生類順鉑樣耐藥性尚未清楚，本研究以順鉑為陽性對(duì)照，采用逐代耐藥篩選實(shí)驗(yàn)，MTT法檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)順鉑(5 μmol/L)處理的A549敏感期IC50值為9.08 μmol/L，培養(yǎng)至第20代，IC50值為30.38 μmol/L，計(jì)算耐藥指數(shù)RI為3.35(表1)，且細(xì)胞存活率呈逐代上升趨勢(shì)(圖4A)，說明A549細(xì)胞對(duì)順鉑逐漸產(chǎn)生耐藥性。相反，經(jīng)紫草素(2 μmol/L)干預(yù)的A549細(xì)胞耐藥指數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(表1)，細(xì)胞存活率呈逐代下降趨勢(shì)(圖4B)表明紫草素?zé)o類順鉑樣耐藥反應(yīng)。

A：A549/DDP耐藥移植瘤裸鼠在給藥期間體質(zhì)量(n=8);B：藥物干預(yù)后各組腫瘤組織體積比較;C：腫瘤組織照片及其重量;*:P<0.05,**:P< 0.01;***:P<0.001，與對(duì)照組比較,△:P<0.05,△△:P<0.01，與順鉑組比較

圖2紫草素對(duì)A549/DDP裸鼠異種移植瘤的抑制作用

A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：腎

圖3藥物干預(yù)后各組移植瘤裸鼠臟器指數(shù)評(píng)估

表1 順鉑及紫草素對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞耐藥指數(shù)評(píng)價(jià)

A：順鉑5 μmol/L ；B：紫草素2 μmol/L干預(yù)下A549細(xì)胞的存活率

圖4 MTT法檢測(cè)長(zhǎng)期順鉑和紫草素

3 討 論

在威脅人類生命健康的各種惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，其主要的原因在于其易發(fā)性、耐藥性和高轉(zhuǎn)移性[8]。肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥是影響療效和預(yù)后的重要因素[2]，因此，鉑類耐藥是臨床治療肺癌的難題，期望能找到有效的抑制劑，與鉑類藥物聯(lián)合使用提高療效。紫草素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用且可增加抗腫瘤治療敏感性[9]。關(guān)于紫草素對(duì)肺腺癌化療逆轉(zhuǎn)耐藥性的研究鮮有報(bào)道，本文通過體內(nèi)、體外相結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫草素在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性條件下能夠逆轉(zhuǎn)人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DPP 對(duì)順鉑的耐藥性，紫草素與順鉑聯(lián)合用藥后，增強(qiáng)順鉑對(duì)肺腺癌耐藥細(xì)胞株的殺傷作用，提高耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性。

綜上所述，紫草素具有逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥作用，而且具有目前臨床藥物所缺乏的高效、安全性較好的優(yōu)勢(shì)，有很大的研究?jī)r(jià)值。