張貞明，柏玉晶，阿不滿，楊成德

(1.甘肅草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070; 3.甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

苜蓿(Medicagosativa)抗逆性強(qiáng)，蛋白含量高，有“牧草之王”的稱號(hào)，具有固氮能力，且根系發(fā)達(dá)，可有效防止表層土壤侵蝕，是保持水土和改土培肥的重要生態(tài)植物[1]；在我國種植面積約3.77×106hm2，居各類人工種草之首[2]，主要分布在內(nèi)蒙古高原、東北地區(qū)、黃土高原、新疆維吾爾自治區(qū)、黃淮海地區(qū)等[3]。但是，隨著苜蓿種植時(shí)間的增長，根腐病發(fā)生日趨嚴(yán)重[4-10]，已成為現(xiàn)階段苜蓿栽培過程中的重要限制因素之一。該病害可為害苜蓿全生育期，侵染根及根頸部位造成根部腐爛，致使根系分支減少，固氮能力降低，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，每年由苜蓿根腐病在全世界造成的苜蓿產(chǎn)量損失在20%左右，發(fā)病嚴(yán)重地塊甚至達(dá)40%[11]。由于栽培區(qū)生態(tài)條件各異，根腐病病原種類有差別[12-13]，目前報(bào)道的病原有29種，其中鐮孢屬(Fusariumspp.)真菌有14種[14]，為引起該病害的優(yōu)勢病原，如黑龍江紫花苜蓿根腐病的主要病原為鐮孢菌和絲核菌(Rhizoctoniasp.)[15]，內(nèi)蒙古中部地區(qū)苜蓿根腐病的優(yōu)勢病原為鐮孢屬真菌[10]，甘肅省定西市苜蓿根腐病的病原為半裸鐮孢菌(F.semitectum)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum) 和尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)[16]。近年來甘肅省武威市苜蓿種植面積越來越大，2017年年底保有面積1.78×104hm2，已成為產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主要作物之一，但局部種植年限較長的田塊根腐病發(fā)生較重，且武威市苜蓿鐮孢根腐病的病原種類有待于進(jìn)一步研究。因此，本研究對(duì)甘肅省武威市苜蓿鐮孢根腐病的病原菌進(jìn)行分離、致病性測定和鑒定，以期為該病害的田間診斷和綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苜蓿根腐病標(biāo)本

于2014年7月18日采自甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)，取樣田為種植3年的甘農(nóng)3號(hào)，對(duì)地上部分有疑似根腐病癥狀的植株隨機(jī)挖取10株進(jìn)行根腐病的初步診斷和癥狀描述，并對(duì)根腐病標(biāo)樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離培養(yǎng)和鑒定。

1.2 癥狀描述

對(duì)紫花苜蓿根腐病地上及地下癥狀進(jìn)行描述并拍照，包括顏色變化、腐爛情況等。

1.3 病原的分離和鑒定

1.3.1病原的分離 采用常規(guī)組織分離法在PSA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂17 g、蒸餾水1 000 mL)進(jìn)行分離培養(yǎng)與菌落邊緣純化，待邊緣純化的菌株產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離純化，后轉(zhuǎn)入PSA斜面保存?zhèn)溆肹17]。

1.3.2致病性測定 采用浸根接種法進(jìn)行致病性測定[17]。具體為將紫花苜蓿播種于塑料花盆中(直徑12 cm)，在室溫條件下培育至40 d苗齡，取出苗，沖洗干凈根表面的泥土后將根部用6號(hào)昆蟲針輕輕扎破表皮，再用分離物106cfu·mL-1的孢子懸浮液浸根15 min，再移栽于花盆繼續(xù)生長；每個(gè)分離物重復(fù)3次，每次重復(fù)3盆，每盆5株，共45株；以無菌水浸根為對(duì)照。接種后連續(xù)觀察植株發(fā)病情況，至有紫花苜蓿葉片黃化和開始落葉時(shí)挖出所有接種植株的根，統(tǒng)計(jì)發(fā)病植株，計(jì)算發(fā)病率，并對(duì)形成典型癥狀的植株進(jìn)行再分離。

1.3.3病原菌的鑒定 將病原菌接種于PSA平板25 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察培養(yǎng)性狀，產(chǎn)孢后觀察分生孢子梗、厚垣孢子、大型分生孢子和小型分生孢子的形態(tài)特征，測量厚垣孢子、小型分生孢子和大型分生孢子大小(50個(gè))，顯微拍照。根據(jù)菌株形態(tài)特征，參考《鐮刀菌屬》[18]和《真菌鑒定手冊(cè)》[19]等進(jìn)行鑒定。

按參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行DNA提取，采用鐮孢霉屬真菌專用引物Fu3(5′-CCG AGTTTACAACTCCCAAA-3′)及Fu4(5′-TCCTCCGCT TAT TGA TAT GC-3′)[21](由華大生物工程有限公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為DNA模板2 μL(以加2 μL雙蒸水為空白對(duì)照)，2×MasterMix 25 μL，引物3 μL，加雙蒸水定容至50 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將具特異性條帶產(chǎn)物送華大生物工程有限公司測序，所測序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)并下載同源性較高的序列，并采用Mega5.0鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

該病害主要為害根，發(fā)病初期根及根頸部形成褐色壞死斑，之后病斑逐漸擴(kuò)大，最后嚴(yán)重腐爛變?yōu)樯詈稚昂谏?，深達(dá)維管束(圖1)；植株地上部初期營養(yǎng)不良的表現(xiàn)，生長緩慢，葉片變黃枯萎，后期嚴(yán)重時(shí)枯死。

圖1 苜蓿根腐病田間癥狀Fig. 1 Field symptoms of alfalfa root rot

2.2 病原菌的分離及致病性測定

根據(jù)分離物菌落形態(tài)、孢子和菌絲形態(tài)獲得8個(gè)鐮孢霉屬真菌分離物，依次編號(hào)為WGF1、WGF2、WGF3、WGF4、WGF5、WGF6、WGF7和WGF8。經(jīng)致病性測定，WGF2、WGF6和WGF7引致苜蓿根腐病的發(fā)病率為100%，致病力強(qiáng)；WGF1的發(fā)病率為75%，WGF3的發(fā)病率為50%，在發(fā)病部位可再分離得到與原接種鐮孢真菌相同的分離物；接種WGF4、WGF5、WGF8和清水對(duì)照的紫花苜蓿無典型癥狀形成(圖2)。該結(jié)果表明WGF1、WGF2、WGF3、WGF6和WGF7為紫花苜蓿根腐病的病原菌，且WGF2、WGF6和WGF7致病性強(qiáng)。

圖2 致病性測定Fig. 2 Pathogenicity testing of the 7 isolates

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定 WGF2和WGF6菌落正面氣生菌絲多，中心淡黃色，背面中心呈橘黃色，邊緣呈淡黃色；菌落圓形，直徑7.9 cm(圖3A、B)；產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗；小型分生孢子紡錘形或啞鈴形，大小(5.48～16.46) μm×(2.3～3.87) μm；大型分生孢子紡錘形或鐮刀形，多為鐮刀形，多3～5隔，兩端為楔形，直或稍彎，大小(14.37～38.92) μm×(3.05～5.19) μm；厚垣孢子球形，直徑(19.32～37.19) μm(圖3C、D)。根據(jù)培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征[18-19]鑒定為半裸鐮孢菌(F.incarnatum)。

WGF3菌落正面氣生菌絲白色絮狀，背面初期呈紫色，后期呈紫黑色；菌落圓形，直徑7.5 cm(圖4A、B)。分生孢子梗短，單瓶梗或多瓶梗；小型分生孢子卵圓形或橢圓形，大小(2.75～7.74) μm×(1.98～3.67) μm；大型分生孢子極少產(chǎn)生，有則多3～5隔，大小(13.41～39.49) μm×(1.3～43.92) μm(圖4C、D)；不形成厚垣孢子。根據(jù)培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征[18-19]鑒定為層出鐮孢菌(F.proliferatum)。

WGF1和WGF7菌落正面氣生菌絲乳白色，發(fā)達(dá)，中央周圍有氣生菌絲塌陷，背面中心顏色略深，邊緣顏色較淺；菌落圓形，生長5 d直徑7.7 cm(圖5A、B)；7 d形成分生孢子；產(chǎn)孢梗單瓶梗，大小(2.4～7.4) μm×(6.5～17.8) μm；大型分生孢子鐮刀形，兩端漸尖，具腳泡，大多為3～5隔，大小(14.5～32.2) μm×(3.4～5.1) μm；小型分生孢子大多為單孢，紡錘形或近橢圓形，較少，大小(8.3～18.7) μm×(2.4～4.4) μm；厚垣孢子間生或串生，圓形或近圓形，直徑(7.1～29.7) μm(圖5C、D、E)。根據(jù)培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征[18-19]鑒定為厚垣鐮孢菌(F.chlamydosporum)。

2.3.2特異性基因序列分析鑒定 利用特異性引物分別對(duì)病原菌WGF2和WGF6基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序，其序列分別長497和496 bp；將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比較，并用Mega(5.0)的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，WGF2和WGF6分別與半裸鐮孢菌KY436233和KJ018790的同源性達(dá)100%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起(圖6)。結(jié)合形態(tài)特征，將其鑒定為半裸鐮孢菌。

圖3 半裸鐮孢形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of F. incarnatum

A,菌落正面；B,菌落背面；C,大型分生孢子；D,厚垣孢子。

A, Upper surface of the colony; B, Reserved surface of the colony; C, Macroconidia of the pathogen; D, Chlamydospore.

圖4 層出鐮孢形態(tài)特征Fig. 4 Morphological characteristics of F. proliferatum

A，菌落正面；B，菌落背面；C，大型分生孢子；D，產(chǎn)孢梗。

A, Upper surface of the colony; B, Reserved surface of the colony; C, Macroconidia of the pathogen; D, Conidiogenous cell.

圖5 厚垣鐮孢菌形態(tài)特征 Fig. 5 Morphological characteristics of F. chlamydosporum

A，菌落正面；B，菌落背面；C，產(chǎn)孢梗；D，大型分生孢子；E，厚垣孢子。

A, Upper surface of the colony; B, Reserved surface of the colony; C, Conidiogenous cell; D, Macroconidia of the pathogen; E, Chlamydospore.

提取WGF3基因組DNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后測序，獲得532 bp的DNA片段，在GenBank中經(jīng)同源性比較，與鐮孢菌KU939075的同源性達(dá)99%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起(圖6)。結(jié)合形態(tài)特征，將其鑒定為層出鐮孢菌。

利用特異性引物分別對(duì)病原菌WGF1和WGF7基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序WGF1和WGF7擴(kuò)增產(chǎn)物分別長509和510 bp，在GenBank中經(jīng)同源性比較，兩病原菌與厚垣鐮孢菌KY347905和KY347904的同源性達(dá)99%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起(圖6)。結(jié)合形態(tài)特征，將WGF1和WGF7鑒定為厚垣鐮孢菌。

圖6 病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogrnetic tree of WGF1，WGF2, WGF3, WGF6 and WGF7

3 討論與結(jié)論

苜蓿根腐病是一種典型的土傳病害，報(bào)道的病原達(dá)29種，其中優(yōu)勢病原為鐮孢菌[14]，其中鐮孢菌主要有茄鐮孢(F.solani)、梨孢鐮孢菌(F.poae)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、串珠鐮孢菌(F.moniliforme)、半裸鐮孢菌、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、鏈狀鐮孢菌(F.fusarioides)、木賊鐮孢菌(F.equiseti)、三線鐮孢菌(F.tricinctum)、接骨木鐮孢菌(F.sambucinum)、銳頂鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、大刀鐮孢菌(F.culmorum)和擬枝孢鐮孢菌[17,22-23]。甘肅省定西市苜蓿根腐病主要由尖孢鐮孢菌、半裸鐮孢菌和銳頂鐮孢菌[16]引起。本研究中僅分離到厚垣鐮孢菌、層出鐮孢菌和半裸鐮孢菌，5株致病菌中厚垣鐮孢菌和半裸鐮孢菌各2株，層出鐮孢菌1株，且沒有分離到尖孢鐮孢菌和銳頂鐮孢菌，說明武威苜蓿根腐病病原種與定西市有差異，且厚垣鐮孢菌和半裸鐮孢菌為強(qiáng)致病力菌株。

菌物形態(tài)除了受基因組控制外，也受環(huán)境因素的影響，特別是部分形態(tài)特征因培養(yǎng)條件的變化而改變，在形態(tài)上表現(xiàn)出多樣性，因此物種鑒定極大地依賴于鑒定者的經(jīng)驗(yàn)，如本研究中厚垣鐮孢菌的分生孢子在PSA培養(yǎng)基上大于PDA培養(yǎng)基上；另外，部分鐮孢菌的產(chǎn)孢條件難以篩選[24]，增大了依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類鑒定的難度，并且菌物形態(tài)特征上的相似性和許多菌株有性時(shí)期的未知性，在培養(yǎng)特征及形態(tài)特征上很難在種的水平上將其分類。因此，分子鑒定方法在菌物鑒定中得到進(jìn)一步擴(kuò)大和應(yīng)用，以便提高種鑒定的準(zhǔn)確性，特別是通過培養(yǎng)特征、表型特征和分子鑒定數(shù)據(jù)等綜合資料和研究者的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合，可以較好地克服單一方法在菌株鑒定中的局限性，提高鑒定的準(zhǔn)確性。分子鑒定方法中rDNA-ITS基因序列分析在鑒定真菌方面應(yīng)用廣泛，如王曉英和劉秀梅[25]綜合鐮孢霉屬真菌rDNA18S、28S、5.8S及其區(qū)間序列ITS1和ITS2設(shè)計(jì)了鐮孢霉屬真菌專用引物Fu3/Fu4，該區(qū)間序列表達(dá)和調(diào)控保守，可以較好地區(qū)分鐮孢霉屬真菌在種一級(jí)的關(guān)系，本研究使用該引物對(duì)所分離的病原鐮孢菌進(jìn)行了鑒定，將5株引起武威市紫花苜蓿根腐病的致病菌分別鑒定為半裸鐮孢菌、層出鐮孢菌和半裸鐮孢菌，豐富了苜蓿根腐病病原的資料，也為甘肅省武威市苜蓿根腐病的診斷和綜合防治提供了依據(jù)。