范大勇,姚佳烽,劉彬彬,徐梓菲

(1.東南大學(xué)建筑設(shè)計(jì)研究院有限公司,南京 210096;2.南京航空航天大學(xué)機(jī)電學(xué)院,南京 210016)

近年來(lái),隨著精密加工技術(shù)越來(lái)越成熟,應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)的微流控芯片也開始快速發(fā)展,為細(xì)胞的檢測(cè)提供了新思路[1]。目前應(yīng)用在細(xì)胞檢測(cè)的方法包括免疫熒光法、細(xì)胞的電化學(xué)分析法、單細(xì)胞質(zhì)譜分析法等。免疫熒光法通過(guò)測(cè)定熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)弱來(lái)定量分析,該方法具有靈敏度高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),但是檢測(cè)前需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[2],從而會(huì)影響細(xì)胞的機(jī)能。細(xì)胞的電化學(xué)分析法通過(guò)分析細(xì)胞在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)來(lái)分析溶液中細(xì)胞的種類,但是不能得到細(xì)胞的位置信息。單細(xì)胞質(zhì)譜分析法是通過(guò)對(duì)細(xì)胞在離子源中產(chǎn)生的離子束分析,可以確定細(xì)胞的質(zhì)量,但是檢測(cè)速度低[3]。電阻抗成像檢測(cè)技術(shù)相比于其他幾種細(xì)胞檢測(cè)技方法,不但可以快速的檢測(cè)細(xì)胞的種類和位置,還具有非侵入免標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞在電檢測(cè)中得到的電阻抗包含電阻和電容兩種成分,并且不同種類的細(xì)胞包含不同的阻抗信息[4]。電阻抗成像技術(shù)是利用了測(cè)量場(chǎng)域內(nèi)部電導(dǎo)率的差異來(lái)進(jìn)行成像[5]。其基本方法為通過(guò)被測(cè)量場(chǎng)域表面的電極對(duì)注入安全的交流電流,測(cè)量其余電極對(duì)在該交流電場(chǎng)內(nèi)的交流電壓,之后利用成像算法通過(guò)測(cè)量值來(lái)重構(gòu)場(chǎng)域內(nèi)部電導(dǎo)率分布圖像。由于輸入電流的電流值以及頻率范圍是安全的,且得益于目前計(jì)算機(jī)速度的飛速發(fā)展,故電阻抗成像檢測(cè)技術(shù)具有安全無(wú)輻射、成像速度快等優(yōu)點(diǎn),是一種新興的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)[6],并擁有廣闊的研發(fā)前景。由于微尺度下電阻抗成像檢測(cè)設(shè)備尺寸小且加工不易,噪聲對(duì)電極采集的信號(hào)具有較大影響,所以對(duì)微尺度電阻抗成像檢測(cè)芯片的設(shè)計(jì)還很少。Yang Y等[7]開發(fā)出了直徑15 mm的微流控芯片,由16個(gè)電極組成電極陣列,可以對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行三維實(shí)時(shí)成像,而且該設(shè)備也可用于對(duì)人體組織的檢測(cè)。Sun等[8]采用PCB技術(shù)開發(fā)出直徑4 mm的微流控芯片,可以對(duì)單細(xì)進(jìn)行胞成像。然而由于結(jié)構(gòu)限制,這些設(shè)備都不支持流動(dòng)狀態(tài)下的細(xì)胞檢測(cè)。

本文設(shè)計(jì)一種用于可流動(dòng)狀態(tài)下細(xì)胞電阻抗成像檢測(cè)的多電極陣列微流控芯片。該芯片可以對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)下的細(xì)胞和流動(dòng)狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行電阻抗成像檢測(cè)。仿真軟件模擬結(jié)果顯示,電極對(duì)內(nèi)部細(xì)胞的位置變化比較敏感,可以通過(guò)電極所測(cè)量的電壓變化計(jì)算出細(xì)胞的空間分布。

1 多電極陣列微流控芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

電極陣列作為微流控芯片的核心,要根據(jù)使用環(huán)境設(shè)計(jì)適宜的尺寸及結(jié)構(gòu)。本文設(shè)計(jì)的多電極陣列微流控芯片需要考慮如下方面:微流控芯片要保持內(nèi)部多相流的流動(dòng)性以滿足不同細(xì)胞的混合;實(shí)現(xiàn)多個(gè)截面的電阻抗成像檢測(cè);芯片與測(cè)量?jī)x器接口的設(shè)計(jì);芯片的固定。

圖1 多電極陣列微流控芯片外觀示意圖

微流控芯片的整體結(jié)構(gòu)如圖1所示,包括PCB板、集成陣列電極的微流道及接口等。芯片通道入口選用“Y”型,方便不同種類細(xì)胞的混合和分離。芯片主通道上分布3個(gè)多電極陣列截面,用于主通道內(nèi)部的電阻抗成像檢測(cè)。PCB板中印刷了芯片所需的電路,電極通過(guò)分布在PCB板兩側(cè)的插針接口與其他儀器進(jìn)行信號(hào)傳輸,芯片的基板則通過(guò)螺釘和固定板固定在PCB板中。

1.1 微流體通道整體設(shè)計(jì)

微通道是芯片的核心,微通道結(jié)構(gòu)決定了通道內(nèi)流體的運(yùn)動(dòng)[9]。微通道包含流體出入口、備用出入口、主輔通道等。以細(xì)胞的分離和檢測(cè)為例,細(xì)胞液和懸浮液分別從不同的入口注入主通道,經(jīng)過(guò)主通道檢測(cè)和分離后不同種類的細(xì)胞液從不同的出口流出。

本著簡(jiǎn)單微加工方法和實(shí)際運(yùn)用操作可行的原則,以及滿足不同種類細(xì)胞混合的要求。本文設(shè)計(jì)的微流體通道的入口和出口設(shè)計(jì)成“Y”型,結(jié)構(gòu)如圖2所示。芯片的整體長(zhǎng)度為L(zhǎng)3=20 mm,寬度W=10 mm。主通道借助四路支路通道達(dá)到與樣品池關(guān)聯(lián)的目的。細(xì)胞液及懸浮液分別經(jīng)過(guò)入口A和入口B進(jìn)入,在主通道處理之后,不同種液體分別從出口C、D流出。支路通道A、B、C、D的直徑相同為100 μm,長(zhǎng)度為L(zhǎng)1=3 mm。電極位于主通道的側(cè)壁上,每個(gè)電極截面間距S=3 mm。主通道的長(zhǎng)度為L(zhǎng)2=10 mm。

圖2 微通道平面的CAD設(shè)計(jì)圖(單位:mm)

1.2 微流體通道橫截面設(shè)計(jì)

微通道要保持內(nèi)部多相流的流動(dòng)狀態(tài)為層流,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在微通道中的有序排布。在粘性力遠(yuǎn)大于慣性力,或者雷諾數(shù)Re≤2 300時(shí)處于層流狀態(tài)。在微通道中處于層流狀態(tài)下的流體可以借助N-S方程得知流體壓力損失情況。雷諾數(shù)方程和N-S方程具體公式為:

Re=ρvd/μ

(1)

式中:ρ和μ分別為流體密度和動(dòng)力粘性系數(shù)(N·s/m2),v和d分別為流場(chǎng)的特征速度(m/s)和特征長(zhǎng)度。從式(1)得知,通道特征長(zhǎng)度d越小,雷諾數(shù)Re越小。

在宏觀流體運(yùn)動(dòng)學(xué)中,常借助比表面積對(duì)流體流動(dòng)性進(jìn)行衡量。對(duì)于型腔截面形狀來(lái)說(shuō),比表面積表示的是型腔表面積與體積的比值。在微尺度通道之中,對(duì)于長(zhǎng)度一致的微流道來(lái)說(shuō),比表面積衡量的是截面周長(zhǎng)比截面面積。如圖3所示,橫截面為圓形的流道的比表面積為40 mm-1,橫截面為菱形的流道的比表面積為56.56 mm-1。由于微流體中流動(dòng)長(zhǎng)度與比表面積表現(xiàn)出了反比關(guān)系[10],圓形相比于菱形具有更小的比表面積,其流動(dòng)長(zhǎng)度更大。所以,可以選擇截面為圓形的微流道。微流體相比于宏觀狀態(tài)下的流體,在進(jìn)行流動(dòng)時(shí)有微尺度效應(yīng),該效應(yīng)使得微流體表面力效用增強(qiáng),黏性力比慣性力大很多。因此有利于微通道內(nèi)流體保持層流狀態(tài),便于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的介電泳分離。

電阻抗成像中圖像重構(gòu)時(shí),電極采集數(shù)據(jù)的精度影響圖像重構(gòu)的質(zhì)量。微通道截面電極不同的結(jié)構(gòu)、數(shù)量和排布方式會(huì)產(chǎn)生不同的電勢(shì)分布。先前的研究考慮到微流控芯片的加工工藝,電極排布到菱形微通道的兩側(cè)(圖3(a)),這種排布方式中利用8個(gè)電極實(shí)現(xiàn)了電阻抗成像檢測(cè)[11]。本研究采用圓形橫截面,電極數(shù)目為8電極、12電極與16電極,電極的排布方式及尺寸如圖3(b)所示。

圖3 微通道不同截面形狀及尺寸(單位:mm)

1.3 電極和芯片材料選擇

微電極是微流控芯片的核心部件,通過(guò)電信號(hào)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的阻抗,以及通過(guò)施加電壓之后所產(chǎn)生的電場(chǎng)來(lái)操控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。由于電極對(duì)于電場(chǎng)的靈敏性要求很高,所以其導(dǎo)電特性對(duì)于內(nèi)電場(chǎng)大小及分布有很大的影響[12]。在生物監(jiān)測(cè)的微流控芯片設(shè)計(jì)上,電極在選擇時(shí)需要考慮:導(dǎo)電性能、抗腐蝕性能、加工工藝以及生物相容性。通過(guò)對(duì)各種常見的電極材料比較,最佳的材料是鉑金(Pt),主要是由于其具有延展性好、熔點(diǎn)高、導(dǎo)熱導(dǎo)電性能好、化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定、不溶于強(qiáng)酸強(qiáng)堿以及具有獨(dú)特的催化作用,符合微流控芯片電極的設(shè)計(jì)要求。

微流控芯片的流道部分可以使用的材料比較多。例如玻璃、單晶硅、石英及有機(jī)聚合物等。考慮到芯片需要耐高溫、抗化學(xué)反映、流道的疏水性以及極低的電導(dǎo)率。對(duì)能夠使用的各種材料進(jìn)行了對(duì)比得知,聚二甲基硅氧烷(PDMS)不僅滿足以上所有要求,同時(shí)還具有高分子材料的優(yōu)勢(shì),不會(huì)有永久性破壞,與芯片材料的要求非常一致;同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)與自身及硅等材料的可逆結(jié)合。本文選取PDMS為芯片制作材料。

1.4 芯片加工方法

選用PDMS作為微流控芯片材料,制作當(dāng)中可以采用的技術(shù)非常多。例如熱壓成型法、模塑法及刻蝕法等。熱壓成型法是指在加熱并同時(shí)加壓的條件下,使材料成型并燒結(jié)成制品。特點(diǎn)是工藝成熟,可以得到致密度很高的制品,但不適合于制作微流控芯片內(nèi)部的多電極陣列?？涛g法是指按照設(shè)計(jì)要求對(duì)材料表面進(jìn)行選擇性腐蝕或剝離,具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)。模塑法首先借助多種技術(shù)(例如刻蝕法)加工出陽(yáng)膜,之后進(jìn)行高分子聚合物的澆筑和固化,再把材料剖離就得到我們想要的芯片。本文采用模塑法分層加工芯片,自下而上根據(jù)每層所需的PDMS和Pt加工出完成的芯片,借助該方法能夠完成相鄰?fù)ǖ谰嚯x僅僅為0.3 μm的結(jié)果。這種方法制作簡(jiǎn)單,能夠進(jìn)行批量制作、成本低、周期短且對(duì)環(huán)境沒(méi)有特殊要求。

2 芯片設(shè)計(jì)仿真分析

2.1 仿真條件和算法

由上文分析可知,微流道的設(shè)計(jì)重點(diǎn)在于橫截面內(nèi)電極排布的設(shè)計(jì),故對(duì)該包含電極的橫截面建立仿真模型并進(jìn)行優(yōu)化分析。仿真模型主要包括通道、電極、細(xì)胞及蒸餾水4個(gè)部分。用一個(gè)直徑為D3=10 μm的圓來(lái)代替細(xì)胞,其電導(dǎo)率為σ細(xì)胞=10-3S/m,相對(duì)介電常數(shù)為ε細(xì)胞=83。電極材料為鉑金(Pt),電導(dǎo)率σ電極=8.9×106S/m,分布在通道兩側(cè),通道溶液材料設(shè)置為蒸餾水,電導(dǎo)率σ水=5.5×10-6S/m,相對(duì)介電常數(shù)為ε水=78。在仿真過(guò)程中分別針對(duì)8電極、12電極、16電極以及菱形8電極進(jìn)行仿真計(jì)算。電極等間距分布在微通道的邊界上,對(duì)相鄰電極施加激勵(lì)電壓U=1 V,同時(shí)采集相鄰電極之間的電位差。

根據(jù)麥克斯韋方程和電磁場(chǎng)理論,對(duì)假設(shè)仿真模型內(nèi)部敏感場(chǎng)為似穩(wěn)場(chǎng)且內(nèi)部沒(méi)有激勵(lì)源。在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)無(wú)電流源存在,則敏感場(chǎng)的數(shù)學(xué)模型為:

·J=0

(2)

場(chǎng)域內(nèi)電阻率分布σ與電位分布Ф所滿足的微分方程為:

·(σФ)=0

(3)

敏感場(chǎng)滿足邊值條件:

σ?Ф/?n=J

(4)

Φ=Φ0

(5)

式中:J為邊界上外加激勵(lì)的電流密度,無(wú)注入電流時(shí)為零;n為場(chǎng)域外法向單位向量;Φ0為邊界上的電位。

圖像重建算法作為EIT逆問(wèn)題求解的核心問(wèn)題被廣泛研究,在此次仿真計(jì)算中采用廣義矢量模式匹配法(GVSPM)經(jīng)行圖像重建。該算法的表達(dá)式如下:

(6)

式中σk是第k次迭代計(jì)算后獲得的電導(dǎo)率,J是雅可比矩陣,U是仿真模型中電極電位進(jìn)行正規(guī)化后的值。

2.2 仿真結(jié)果分析

對(duì)應(yīng)圖3設(shè)計(jì)出來(lái)的幾種橫截面,采用計(jì)算機(jī)仿真方法進(jìn)行了細(xì)胞檢測(cè)能力對(duì)比。在仿真過(guò)程中,對(duì)3個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞群穿過(guò)微通道時(shí),微通道內(nèi)截面進(jìn)行仿真分析。圖4為不同電極傳感器仿真模型圖與通過(guò)廣義矢量模式匹配法(GVSPM)圖像重構(gòu)算法經(jīng)行圖像重建之后的結(jié)果圖的比較。亮色代表高電導(dǎo)率的細(xì)胞群,暗色部分代表的是低電導(dǎo)率的蒸餾水。

圖4 圖像重建模型和仿真結(jié)果

為了對(duì)仿真結(jié)果與仿真模型之間的相關(guān)性定量分析,本文引進(jìn)參數(shù):圖像相關(guān)性IC

(7)

相鄰電極激勵(lì)模式能夠在相同電極數(shù)目的情況下獲得更多的獨(dú)立數(shù)據(jù),但是激勵(lì)電流主要分布管道邊緣,管道邊緣成像分辨率較高,管道中心部分成像分辨率較低。與圓形管道相比,在相同電極數(shù)時(shí),電極均勻分布在菱形管道邊緣會(huì)使得細(xì)胞群位置更靠近管道邊緣,提升管道中心部分成像質(zhì)量。但是當(dāng)細(xì)胞群位置靠經(jīng)菱形管道邊角時(shí),電位分布不規(guī)律,成像質(zhì)量會(huì)迅速下滑。在圖5中,圓形管道傳感器所得圖像相關(guān)性隨著細(xì)胞群中心與管道中心距離的增加而增加。菱形傳感器D-8成像質(zhì)量不穩(wěn)定,當(dāng)細(xì)胞群位置靠近電極時(shí),成像質(zhì)量嚴(yán)重下降。細(xì)胞群中心位置在變化過(guò)程中,不同電極傳感器得到的圖像重建質(zhì)量各有優(yōu)劣,16電極傳感器成像圖像相關(guān)性的平均值以及極差要優(yōu)于8電極和12電極傳感器。

圖5 不同電極傳感器圖像相關(guān)性與細(xì)胞群 中心位置的關(guān)系

圖6給出的是細(xì)胞群中心在相同位置處,不同電極傳感器圖像相關(guān)性的比較。圖6(a)為細(xì)胞群中心位于管道中心位置時(shí),圓形12電極傳感器成像質(zhì)量?jī)?yōu)于其他類型電極傳感器。對(duì)于圓形管道截面,當(dāng)電極數(shù)目增加時(shí),能夠采集更多的測(cè)量數(shù)據(jù),從而提高圖像重建質(zhì)量。電極數(shù)目的增加也會(huì)擴(kuò)大有用信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍,在測(cè)量精度和計(jì)算次數(shù)一定時(shí)會(huì)使成像質(zhì)量下降,成像效果會(huì)隨模型位置的不同在更大的范圍內(nèi)變化。圖6(b)為細(xì)胞群中心距管道中心距離0.01 mm處,不同傳感器成像的圖像相關(guān)性比較。在選定的兩個(gè)位置處,菱形8電極傳感器成像質(zhì)量都要優(yōu)于圓形8電極傳感器。圓形傳感器的成像質(zhì)量隨著電極數(shù)目的增多逐漸增強(qiáng),16電極傳感器成像質(zhì)量會(huì)高于8電極和12電極傳感器。圖6(c)為細(xì)胞群中心距離管道中心0.02 mm處成像質(zhì)量的比較,此處各電極傳感器成像的圖像相關(guān)性較為接近。圖6(d)為細(xì)胞群中心距離管道中心0.035 mm處成像質(zhì)量的比較,菱形8電極傳感器成像質(zhì)量嚴(yán)重下降,說(shuō)明菱形電極傳感器成像質(zhì)量不穩(wěn)定。由于微流控芯片不僅用于成像,還用于細(xì)胞的分離,在細(xì)胞的分離過(guò)程中細(xì)胞逐漸趨近微流道內(nèi)壁。微流道內(nèi)壁部分成像質(zhì)量相比于其他位置成像質(zhì)量更加重要,結(jié)合電極傳感器成像圖像相關(guān)性的平均值分析。圓形電極傳感器中,16電極傳感器成像質(zhì)量普遍優(yōu)于8電極傳感器和12電極傳感器。

圖6 不同電極傳感器在相同細(xì)胞群中心 位置時(shí)的圖像相關(guān)性

電極越多,可以增加分辨率,提高成像質(zhì)量。由于受空間限制,過(guò)多的電極導(dǎo)致又導(dǎo)致電極尺寸的減小,導(dǎo)致兩電極間采集的信號(hào)微弱,減低了信號(hào)的敏感性,同時(shí),過(guò)多電極也會(huì)大大降低采用速率,導(dǎo)致成像速度慢。因此,本文設(shè)計(jì)的微流控芯片傳感器選用圓形橫截面16電極傳感器。

設(shè)計(jì)出來(lái)的16電極陣列微流控芯片突破了傳統(tǒng)微流路尺寸的設(shè)計(jì)技術(shù)限制,能夠?qū)⒍嚯姌O陣列于流路周圍,擴(kuò)大了微流路的管道直徑,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)電阻抗成像檢測(cè)嗎,而且在細(xì)胞分離方面,可以充分利用介電泳力,在不減少介電泳力(Dielectrophoretic force)的條件下增大了細(xì)胞的流動(dòng)量,大大提高了細(xì)胞的分離速度。

3 結(jié)論

微流控芯片中電阻抗成像不僅可以觀察到細(xì)胞的分布,還可以對(duì)細(xì)胞分離起著指導(dǎo)作用。本文設(shè)計(jì)了一種用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電阻抗成像檢測(cè)的多電極陣列微流控芯片,并采用數(shù)值仿真方法對(duì)設(shè)計(jì)出來(lái)的微流控芯片進(jìn)行了對(duì)比分析,并得到了最優(yōu)方案。具體結(jié)論如下:

①對(duì)微流控芯片進(jìn)行整體設(shè)計(jì),采用嵌入8,12和16電極的圓形橫截面,并與菱形橫截面進(jìn)行了對(duì)比討論。

②在芯片材料選擇上主要考慮透光性、生物兼容性、加工工藝等因素,綜合各種因素,最后選擇了采用PDMS制作芯片。在電極材料選擇上主要考慮導(dǎo)電性能、抗腐蝕性能、加工工藝等因素,最終選擇物理和化學(xué)性能都很穩(wěn)定的鉑金(Pt)。

③運(yùn)用數(shù)值計(jì)算方法建立了微流道內(nèi)細(xì)胞群模型,并對(duì)主通道橫截面內(nèi)的電場(chǎng)分布進(jìn)行了計(jì)算,對(duì)不同的細(xì)胞位置在不同類型的電極橫截面中成像質(zhì)量進(jìn)行了對(duì)比分析。最終選擇含有16電極的圓形橫截面微流控芯片作為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

該研究對(duì)大流量細(xì)胞分離和檢測(cè)微流控芯片的設(shè)計(jì)提供了思路與一定的理論參考,可以實(shí)現(xiàn)3D微尺度細(xì)胞電阻抗成像檢測(cè)與特異細(xì)胞的介電泳分離。