史夢柔 ，婁建石 ，李光遠 ，鄭 奪 ，陳 斌 ，高 萍 ，李毅敏

（1.天津醫(yī)科大學藥理學教研室，天津 300070；2.天津市醫(yī)藥科學研究所醫(yī)用生物材料監(jiān)測研究中心，天津 300020）

以羧甲基殼聚糖為載體材料的納米給藥系統(tǒng)已被用于經皮給藥的治療研究[1-2]。該給藥系統(tǒng)具有控制藥物釋放，降低毒副作用，延長藥物作用時間，減少給藥次數(shù)等優(yōu)點。羧甲基殼聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、不同程度的抗感染作用和較好的止血活性，是目前具有發(fā)展前途的天然高分子納米粒載體材料[3]。納米銀是近年來抗菌藥物的研究熱點[4]，其抗菌機制獨特，廣譜殺菌且無耐藥性，滲透性強，能夠促進傷口的愈合，細胞的生長及受損細胞的修復，是最新一代的天然抗菌劑[5]。但銀離子一旦游離，容易經人體創(chuàng)面吸收入血，通過腎臟從尿中大量排泄的同時，可以在機體的肝、腎、角膜、粘膜組織和創(chuàng)面上皮處沉積[6]，且其粒徑小，化學性質活潑，極易發(fā)生團聚，形成帶有若干弱連接界面且尺寸較大的團聚體[7]，從而影響了納米銀粒子的實際應用效果，因此不適宜直接給藥。制成載藥納米微球，既可以降低其毒性，又可通過羧甲基殼聚糖成分包覆納米銀離子以防止其被氧化或團聚而失去活性[8-10]。本研究采用離子交聯(lián)法制備羧甲基殼聚糖－納米銀納米微球，探討其制備工藝和載藥性能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑 納米銀溶液（張家港耐爾納米科技有限公司4 000 ppm），羧甲基殼聚糖（CMC，浙江澳興生物科技有限公司，分子量30萬，羧化度80%），三聚磷酸鈉（TPP，分析純），去離子水（自制）。

1.1.2 儀器 AL204電子天平（梅特勒－托利多有限公司），KQ-50E超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），Model J2-21低溫高速離心機，Zetasize粒徑分析儀（Malvern公司），透析袋（透過 分 子 量 8 000-14 000，sigma）， 藥 物 溶 出 儀（RC12A，天大天發(fā)）。

1.2 方法

1.2.1 納米微球制備[2]以0.5%鹽酸為溶劑，配制4.2、6.3和8.4 mg/mL的CMC溶液；以0.5%鹽酸為溶劑，配制 2.8、3.7、4.7、5.6、6.5、7.5 和 8.4 mg/mL 的TPP溶液。離子交聯(lián)法制備空白納米微球，取一定濃度的CMC溶液20 mL，超聲狀態(tài)下滴入一定濃度的TPP溶液，繼續(xù)超聲15 min，肉眼觀察并記錄不同配方體系的相變狀態(tài)，體系呈現(xiàn)乳光時為形成納米微球混懸液。

1.2.2 納米銀溶液含量測定方法的確定

1.2.2.1 測定波長的選擇：精密量取200 μL的納米銀溶液于1 000 mL棕色容量瓶中，用去離子水定容，配制成含納米銀50.00 mg/L的儲備溶液，以去離子水作空白參比，利用紫外可見分光光度計，在200～900 nm范圍內進行全波長掃描。

1.2.2.2 標準曲線的繪制：用移液管取儲備液適量，精確配制成濃度為2.00 mg/L、4.00 mg/L、8.00 mg/L、10.00 mg/L的納米銀溶液。以去離子水為參比，在410 nm下使用可見紫外分光光度計測定其吸光度，每組平行測定3次，取3次平均值，并以濃度C對吸光度A作圖。

1.2.2.3 穩(wěn)定性試驗：取濃度為8.00 mg/L納米銀溶液 50 mL，室溫避光自然放置，于 0、2、4、6、8 h 取納米銀溶液3 mL，測量其在410 nm處的吸光度，每組平行3次。

1.2.2.4 精密度試驗：按照1.2.2.2項所示方法，取濃度為4.00、6.00、8.00 mg/L的納米銀溶液3 mL，一天內重復測定5次及連續(xù)測定5 d，分別計算日內、日間變異系數(shù)。

1.2.2.5 準確度試驗：隨機移取一定體積的納米銀溶液，經PBS緩沖液稀釋分別獲得精確濃度為4.58 mg/L、7.95 mg/L和9.24 mg/L的納米銀溶液。取各濃度納米銀溶液3 mL，測定其410 nm處吸光度，每個濃度測3次。將測得的各濃度吸光度值代入回歸方程，計算納米銀溶液的濃度，計算回收率。以回收率表示準確度。

1.2.3 正交試驗 選擇CMC溶液濃度（A），TPP溶液滴速（B），納米銀投入量（C）和空白因素（D）為 4個試驗因素，TPP溶液濃度為3.1項中所選TPP溶液濃度。每個因素設3個水平，按照L9（34）正交設計（見表1），以包封率、納米微球粒徑及多分散系數(shù)作為考察指標，選出最優(yōu)工藝。設定包封率的權重系數(shù)為0.4，納米微球粒徑的權重系數(shù)為0.3，多分散系數(shù)的權重系數(shù)為0.3，綜合評分=［0.4X/61.67+0.3（1 000-Y）/485.9+0.3（1-Z）/0.808］×100%。將納米銀溶液加入不同濃度的20 mL CMC溶液中，避光超聲10 min，待其完全溶解，超聲狀態(tài)下按照相應滴速滴入不同濃度的TPP溶液5 mL，繼續(xù)超聲10 min，各組制得的納米微球混懸液于4℃，16 000 r/min離心10 min，取上清液，定容至25 mL，稀釋50倍，按照正交試驗表分別取3 mL溶液測量吸光度，代入標準曲線計算上清液中納米銀溶液濃度和包封率。

包封率=（納米銀投入量－上清液中納米銀質量）/納米銀投入量×100%。

使用粒徑分析儀測量各組試驗納米微球粒徑范圍和多分散系數(shù)。

表1 正交因素水平表Tab 1 Table of orthogonal factors

1.2.4 納米微球的體外釋放試驗 結合正交試驗結果，選取綜合評分最高的3組實驗工藝制備出的納米微球進行體外釋放試驗。將各組載藥納米微球混懸液10 mL置于處理后的透析袋內，扎牢兩端，綁于溶出儀的攪拌槳上。釋放條件：pH 7.4的PBS緩沖液 500 mL，37 ℃，50 r/min，在 15、30、45 min、1、2、3、4、5、6、7、8 h 取樣 3 mL，補充相同體積的介質。紫外分光光度法測量樣品410 nm處吸光值，平行3次，計算累計釋放量，繪制體外釋放曲線。每組工藝選取3批樣品分別進行測定，結果取平均值。

1.2.5 納米微球體外釋放擬合 選擇累計釋放率最高組，使用Origin 8進行擬合，計算R2。

1.2.6 納米微球的貯存穩(wěn)定性測定 取3批最優(yōu)工藝制備出的納米銀納米微球樣品，避光密封貯存于4 ℃條件下，于第 0、1、7、14、30d 按照1.2.3 項中測定包封率的方法測定納米微球離心后上清液的吸光度，代入標準曲線計算納米銀溶液濃度，以納米銀的析出量表示納米微球的穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 納米微球制備 選擇每個配方中，體系呈現(xiàn)乳光時所用的最高TPP溶液的濃度，作為之后正交分析時所用的TPP溶液濃度，此時納米微粒的交聯(lián)較充分。不同配方時體系的相變狀態(tài)見表2。

表2 反應體系相變狀態(tài)Tab 2 Phase transition of the reaction system

2.2 納米銀溶液含量測定方法的確定

2.2.1 測定波長的選擇 掃描結果見圖1。顯示納米銀溶液在410nm處出現(xiàn)一特征峰。故擬在410 nm處討論測定納米銀濃度的可行性。

2.2.2 標準曲線的繪制 得到回歸方程A＝0.1541C＋0.008，R2=0.9999，結果見圖 2。顯示納米銀溶液的濃度與吸光度之間存在線性關系。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 結果見表3。顯示溶液在8h內穩(wěn)定性良好。

圖1 納米銀溶液的紫外－可見吸收光譜（20.00 mg/mL）Fig 1 UV-Vis spectra of nanosilver solutions（20.00 mg/mL）

圖2 納米銀溶液標準曲線（410 nm）Fig 2 Standard curveof nanosilver solutions（410 nm）

2.2.4 精密度試驗 結果見表4。日內日間精密度均符合含量測定要求。

表3 納米銀穩(wěn)定性試驗結果（x±s，n=3）Tab 3 Results of stability test of nanosilver

表4 納米銀精密度試驗結果（x±s，n=3）Tab 4 Results of accuracy test of nanosliver（x±s，n=3）

2.2.5 準確度試驗 結果見表5，顯示回收率均符合含量測定要求。

表5 納米銀回收率試驗結果（x±s，n=3）Tab 5 Results of recovery test of nanosliver（x±s，n=3）

2.3 正交試驗 結果見表6。利用SPSS21.0對正交試驗結果進行方差分析，結果見表7。

由表6可判斷出在所選因素水平范圍內，各因素的重要次序為A＞B＞C，即羧甲基殼聚糖溶液濃度＞滴速＞納米銀投入量。表7顯示因素A有顯著性影響，而因素B和C不具有顯著性影響。選擇A3作為最優(yōu)項，可以獲得包封率較高，多分散系數(shù)較小的納米微球。選擇B1作為最優(yōu)項，制備的納米微球粒徑更小。綜合評分顯示，A3B1C2為最優(yōu)工藝。

2.4 驗證試驗 選用最優(yōu)工藝的配方重復試驗3次，測得包封率分別為61.52%、60.33%和61.70%。

2.5 納米微球的體外釋放 根據(jù)正交試驗結果，選取第4組、第7組、第9組工藝制備出的納米微球進行體外釋放試驗，各組釋放曲線見圖3。如圖可見第7組納米微球綜合評分最高，納米銀釋放過程前2 h內釋放出約50%的藥量，之后釋放比較平緩，8 h累計釋出80%藥量。與第4組和第9組比較，第7組納米微球釋藥較完全。

表6 正交試驗結果Tab 6 Results of orthogonal test

圖3 不同制備工藝的載藥納米微球的體外釋放曲線（n＝3）Fig3 Releasing curve of drug-loadednanoparticles by different preparation techniques in vitro（n＝3）

2.6 載納米銀納米微球水凝膠體外釋放擬合結果 結果見表8?？梢娖湟患壏匠虜M合較好。

2.7 載納米銀納米微球貯存穩(wěn)定性測定 結果見表9。載藥納米微球在4℃下放置30 d無沉淀，離心后其上清液中納米銀析出較少，結果顯示其30 d內貯存穩(wěn)定性良好。

表7 方差分析Tab 7 Analysis of variance

表8 載藥納米微球體外釋放擬合結果Tab8 Theresultofdrug-loadednanonanoparticlesonrelevantfitting

表9 載藥納米微球穩(wěn)定性結果Tab 9 The result of drug-loaded nanonanoparticles on stability

3 討論

離子交聯(lián)法是制備納米粒的一種常用方法。此方法的反應條件溫和，不使用有機溶劑，且易于得到均一、可調整粒徑范圍的納米粒[12]。鄒競[13]等采用離子交聯(lián)法制備了殼聚糖載吡蟲啉納米微球，考察了其載藥性能。張桂賢[2]等研究了乳化交聯(lián)法制備羧甲基殼聚糖-醋甲唑胺納米微球，包封率達56%。本實驗采用離子交聯(lián)法制備載藥納米微球，利用無毒副作用的TPP對羧甲基殼聚糖進行離子誘導凝膠化而制備納米粒，方法簡單，工藝穩(wěn)定且制得載藥納米微球包封率較高，粒徑較小，分布均勻，為載銀納米微球的制備提供了最佳工藝。

本實驗中使用4.2 mg/mL CMC溶液，7.5 mg/mL TPP溶液制備載藥納米微球，藥物包封率高于使用其它兩個濃度，可能是較高濃度的CMC溶液和較低濃度的TPP溶液在尚未交聯(lián)完全時就趨向形成沉淀導致交聯(lián)不完全。而此水平納米微球分布較其它兩水平更均勻，可能是由于若CMC溶液濃度過高，反應介質粘度增大，納米銀分散較差，導致在分散介質中發(fā)生團聚而使制得的納米微球粒徑增大且分布不勻。實驗中控制TPP溶液的滴速在5 s/滴，制備出的載藥納米微球粒徑明顯小于另外兩個水平，可能是減慢了TPP溶液滴入CMC溶液中的速度，使CMC與TPP交聯(lián)時間充足而制得載藥納米微球的粒徑更小[14]。

本研究選取了正交試驗綜合評分最高的3組工藝制得的納米微球進行體外釋放考察，結果顯示評分最高組較其他兩組釋藥更完全且起始釋放速率較快，這可能是由于此工藝制備出的納米微球粒徑更小[15]。粒徑較大的納米微球，其核心納米銀出現(xiàn)團聚的現(xiàn)象，釋放時要通過載體材料較為困難，影響了釋藥效果。

從釋放結果可以看出該制劑存在突釋現(xiàn)象。在前2 h釋放出約50%的藥量，之后會緩慢釋放。這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他納米微球緩釋劑中。這是由于吸附在納米微球表面的藥物率先大量釋放，而包裹入納米球中的藥物要透過載體材料釋放或在載體材料崩解后釋放，所以釋放較為緩慢平穩(wěn)[16]。感染早期，充足的釋藥量可以迅速提高血液中藥物的濃度，使血藥濃度更快地達到穩(wěn)態(tài)，達到抑菌效果，之后緩慢釋放，可以長時間維持藥物有效濃度，減少給藥次數(shù)。

在貯藏條件下，納米微球穩(wěn)定性良好，30 d內納米銀從微球中基本無析出，作為載體的羧甲基殼聚糖沒有出現(xiàn)溶解崩裂等現(xiàn)象，為該制劑今后的應用提供基礎。

該實驗證明通過離子交聯(lián)法可制備出以羧甲基殼聚糖為載體，載納米銀的納米微球，其安全性和局部抗感染作用還需進一步研究。