徐 奎 王靈敏 楊 昊 洪 嶺 劉依萍 滕曉明*

1. 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬生殖醫(yī)學(xué)中心（山東濰坊 261053）；2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院

1978年7月25日，世界上第一例試管嬰兒Louise Joy Brown在英國出生。距今為止，輔助生殖技術(shù)在全球已經(jīng)開展了40多年的時間，并已廣泛應(yīng)用于臨床，幫助許多不孕不育夫婦擁有了自己的孩子。雖然目前的試管嬰兒技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得相當(dāng)成熟，但臨床妊娠率仍然僅約40%～50%。其中，男方的精子質(zhì)量往往是不容忽視的一個重要因素。

一般來說，精液檢查項目包括精液量、精子濃度、精子活力、精子形態(tài)等。隨著對男性不育了解的深入，以往的常規(guī)檢查往往具有一定的局限性，并不能全面地反映出男方精液的質(zhì)量和受精卵的發(fā)育狀況。近些年來，DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index, DFI）已經(jīng)被認(rèn)為是評價精子質(zhì)量的一項重要指標(biāo)[1]。DFI反映的是精子遺傳物質(zhì)的完整性，其目前的檢測方法主要有精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測定法（sperm chromatin structure assay, SCSA）、精子染色質(zhì)擴(kuò)散法（sperm chromatin dispersion, SCD）、末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）、彗星測定法（comet assay）等[2,3]。本實驗主要是比較分析SCSA和SCD兩種方法檢測DFI的結(jié)果，為以后DFI檢測方法的選擇提供參考。

資料與方法

一、研究對象

研究對象為2017年5月至2018年4月在上海市第一婦嬰保健院（同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院）生殖醫(yī)學(xué)中心男科實驗室就診的男性患者精液標(biāo)本，所有標(biāo)本的取精時間均控制在禁欲2～7d，將精液在未檢測前保存于-20℃冰箱，3d內(nèi)完成檢測，共165份。

該實驗納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）身體健康者；（2）無睪丸外傷、腮腺炎、家族遺傳性疾病及性功能障礙病史者；（3）無不良生活嗜好（酗酒、吸煙等）者。排除標(biāo)準(zhǔn)：男科檢查時發(fā)現(xiàn)睪丸、附睪、輸精管等有異常者。

二、方法

（一）SCSA

本方法采用浙江星博生物科技股份有限公司生產(chǎn)的精子核完整性染色試劑。該產(chǎn)品生產(chǎn)備案憑證備案編號：浙甬食藥監(jiān)械生產(chǎn)備20140013號。該產(chǎn)品備案編號：浙甬械備20160051號。

該產(chǎn)品試劑盒由試劑A、B、C1、C2等4部分組成。A的成分包含Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）、NaCl、EDTA（乙二胺四乙酸）等；B的成分包含HCl、NaCl、Trition X-100（曲拉通 X-100）等；C1的成分包含檸檬酸、Na2HPO4（磷酸氫二鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、NaCl等；C2的成分包含AO（吖啶橙）等。在實驗前，將C2液離心后添加到C1液中混合形成C液，混合后C液在2～8℃中避光可保存2個星期。

取出凍存的樣品，立即置于37℃水浴解凍，冰塊剛?cè)诨鸵⒓慈〕?，光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)。根據(jù)計數(shù)的精子濃度，取一定量的精液，用A液稀釋至100μL，終濃度為（1～2）×106個/mL的精子細(xì)胞。在稀釋后的精液中滴加200μL的B液，準(zhǔn)確計時30s之后，迅速滴加600μL C液，避光染色5min。使用BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，平衡樣品線后將配制好的待檢測樣本加入樣品室，啟動樣品流，用低速檢測樣本，流動速度應(yīng)控制在100～300個/s。待流速穩(wěn)定后開始收集數(shù)據(jù)，至少應(yīng)有5000個細(xì)胞的測定值加以記錄和統(tǒng)計。

精子核經(jīng)過B液處理后，利用C液中吖啶橙染料的異染色質(zhì)，使完整的精子核顯綠色熒光，而受損的精子核顯紅色熒光。若紅光比值增高，說明精子核DFI增高。

（二）SCD

本方法采用安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司生產(chǎn)的精子DNA碎片染色試劑盒（瑞-吉染色法）。該產(chǎn)品備案憑證編號：皖合械備20160005號。

該產(chǎn)品試劑盒是由染液A、染液B、染液C、染液D、染液E和預(yù)處理玻片等組成。

取待檢精液標(biāo)本，用PBS調(diào)整濃度至（5～10）×106/mL。將染液A放置在100℃下5min，使其溶解后，再放置在37℃下5min。加入30μL精液標(biāo)本于溶解后的A液中，充分混勻。取一張預(yù)處理玻片置4℃面板上，待玻片冷卻后，取20μL樣本加到玻片上并標(biāo)記位置，蓋上蓋玻片，放入4℃冰箱中5min。把染液B加入9mL蒸餾水中，平皿中混勻；小心劃拉取開蓋玻片，水平置入溶液B中。室溫放置7min后，取出玻片，水平置入10mL染液C平皿中。室溫放置35min后，置入裝有蒸餾水平皿中5min，然后分別置入70%、90%、100%乙醇中2min，取出自然晾干。加10～12滴染液D染色1～3min，加10～12滴染液E用洗耳球輕輕吹勻，染色10～15min。用純凈水洗滌玻片，封片劑封片。用光學(xué)顯微鏡，于1 000倍油鏡下觀察500個精子圖片形態(tài)。

精液經(jīng)處理后染色，沒有DNA碎片的精子在經(jīng)過酸變性和去掉核蛋白后，DNA擴(kuò)散形成特征性的暈環(huán)，而帶有DNA碎片化的精子不會產(chǎn)生這種特征性的暈環(huán)，根據(jù)暈環(huán)的有無和大小判斷精子的DNA碎片化程度，從而進(jìn)一步計算DFI。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩種方法檢測精子DFI的相關(guān)性

由圖1分別可以看出，本實驗中SCSA與SCD檢測精子DFI的相關(guān)系數(shù)r= 0.598（P＜0.01），表明兩種方法檢測DFI結(jié)果具有顯著的相關(guān)性。SCSA檢測DFI的均值為（13.64±0.81）%，SCD檢測DFI的均值為（19.17±0.93）%，SCD測得的DFI均值較SCSA高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 SCD檢測精子DFI的相關(guān)性分析（單位： SCSA與%）

二、不同分組中兩種方法檢測精子DFI均值及其相關(guān)性的比較

根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）對精子濃度、精子活力和精子形態(tài)的參考值規(guī)定分組：

1. 按精子濃度分組：將精子濃度為（0～5）×106/mL的作為重度低濃度組，濃度為（5～10）×106/mL的作為中度低濃度組，濃度為（10～15）×106/mL的作為輕度低濃度組；濃度區(qū)間＞15×106/mL作為正常濃度組。

2. 按精子活力分組：將精子前項運(yùn)動百分率（PR）＜32%作為弱精子組，PR≥32%作為正?；盍M。

3. 按精子形態(tài)分組：將精子正常形態(tài)率＜4%作為畸精子組，精子正常形態(tài)率≥4%作為正常形態(tài)組。

從表1中可以看出，對于SCSA與SCD之間均值的差異，在重度低濃度組中，SCSA與SCD檢測精子DFI的均值差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在其他各組中，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。另外，從表2可以看出在重度低濃度組中，SCSA與SCD檢測精子DFI均值的相關(guān)系數(shù)r= 0.060（P＞0.05），表明兩種方法檢測DFI結(jié)果在重度低濃度組中無明顯相關(guān)性。隨著濃度逐漸升高，其相關(guān)性也隨之增大。在精子活力和形態(tài)方面，其相關(guān)性較好而且相對比較穩(wěn)定。

表1 不同分組中SCSA與SCD檢測精子DFI的均值比較（%）

表2 不同分組中SCSA與SCD檢測精子DFI均值相關(guān)性的比較

討 論

男性的精子是在睪丸的生精小管中產(chǎn)生的，在精子發(fā)生過程之前，男性精子中的染色體是由遺傳物質(zhì)DNA與4種不同類型的核小體包裹組成的。在卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）和黃體生成素（luteotropic hormone, LH）的作用下，精子發(fā)生時，魚精蛋白替代了原先的組蛋白。在非轉(zhuǎn)錄時，魚精蛋白包裹著DNA，高度濃縮聚集在細(xì)胞核中，保護(hù)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，避免其遺傳物質(zhì)的變異和丟失，維持了遺傳信息的穩(wěn)定性，從而延續(xù)了物種的延續(xù)。美國Larson等研究發(fā)現(xiàn)[4]，目前因不明原因前來就診的男性患者中，經(jīng)DFI檢測發(fā)現(xiàn)其DNA受損程度較高，這也為臨床診斷男性不育提供了一種診療方向。隨著生殖領(lǐng)域?qū)覦FI的逐漸重視，其目前已經(jīng)成為了研究的熱點。在近幾年的報道中[5,6]，已經(jīng)有關(guān)于精子DFI與精液參數(shù)和精子形態(tài)之間相關(guān)性的研究。目前，在臨床上主要采用的是SCSA和SCD這兩種方法測定DFI。

SCSA測定DFI時，正常精子的DNA與魚精蛋白緊密結(jié)合，其具有抗酸特性，不易受到外界環(huán)境的影響，從而可以維持DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而受損精子的DNA結(jié)構(gòu)松散，在酸性環(huán)境下雙鏈DNA解鏈成單鏈DNA。在進(jìn)行實驗室檢測時，吖啶橙與雙鏈DNA結(jié)合顯示綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合顯示紅色熒光。根據(jù)待檢測精液樣本的精子DNA受損情況不同，其所帶的熒光信號也各有差異。熒光信號可以通過流式細(xì)胞儀對大量的精子DNA碎片情況進(jìn)行分析，從而得出不同精子的DFI[7]。

SCD的檢測方法是從精子細(xì)胞最初的化學(xué)變性，即由于精子細(xì)胞核和細(xì)胞膜的脫蛋白作用，DNA斷裂位點的末端開始形成單鏈DNA的過程[8]。這種檢測方法會使得DNA產(chǎn)生一種圍繞在細(xì)胞核周圍的暈環(huán)，在顯微鏡下可以根據(jù)暈環(huán)的大小確定精子DNA受損的程度[8]。損傷小或基本沒有損傷的精子核DNA會形成大的暈環(huán)，而那些損傷較為嚴(yán)重的精子核DNA則不產(chǎn)生明顯的暈環(huán)[9]。我們通過對暈環(huán)的大小進(jìn)行分類和計數(shù)，可以求出DFI，進(jìn)而來了解精子的受損情況。

本實驗所檢測的標(biāo)本統(tǒng)一為-20℃保存1～3d的精液。采用冷凍精液標(biāo)本檢測，主要是因為臨床客觀條件的限制。由于樣本量大，男科實驗室人力有限，只能采取冷凍精液后集中分批檢測的方式。其次，有研究表明[10,11]，最好在精液液化后4h之內(nèi)進(jìn)行檢查效果最佳，否則，應(yīng)當(dāng)對精液標(biāo)本進(jìn)行冷凍保存，可避免因長時間在室溫下放置而對精子的DNA造成損傷。最后，SCSA與SCD兩種方法都是檢測同等條件下的精液樣本，橫向比較條件上無差異。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，SCSA與SCD檢測精子DFI具有顯著相關(guān)性，但兩種檢測方法的均值有顯著性差異，而且SCD測得的精子DFI均值比SCSA較高。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是由于SCD檢測精子核周圍暈環(huán)的大小帶有人為主觀性的判斷，而且觀察者的工作經(jīng)驗程度也會影響最終的結(jié)局判斷。相比較而言，SCSA是由機(jī)器測定精子DFI，具有客觀性，只要操作者在制備樣品過程中嚴(yán)格遵循實驗步驟，就可以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。但由于SCSA需要購置流式細(xì)胞儀，其成本過高，普通醫(yī)療機(jī)構(gòu)很難負(fù)擔(dān)得起。相反，SCD相對來說價格較低廉，可以被大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)所接受。

通過對精子濃度、精子活力和精子形態(tài)進(jìn)行分組對比，我們發(fā)現(xiàn)在重度低濃度組中，SCSA與SCD對精子DFI檢測結(jié)果均值的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而且也沒有明顯的相關(guān)性。而在其余各組中，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是當(dāng)精子濃度極低（＜5×106/mL）時，由于精子樣本的數(shù)量少，SCD在暈環(huán)大小計數(shù)的數(shù)量上與SCSA法相近。其次，因為流式細(xì)胞儀對于檢測濃度極低的樣本有局限性。如果濃度特別低，檢測樣本時間較長，檢測的精子數(shù)量不能滿足流式細(xì)胞儀的檢測要求。而且由于長時間檢測，前一份精液樣本的殘余對之后的精液樣本產(chǎn)生的影響也比較大。最后，根據(jù)精子濃度分組后，重度低濃度組與其他各組相比，包含的樣本量相對較少，或許也是得出該實驗結(jié)果的一個原因?？傊摻Y(jié)果可給醫(yī)生在臨床上提供重要的提醒，當(dāng)遇到一份重度低濃度精液檢測報告時，其本次檢測的精子DFI報告要慎重參考。另外，由于其他各組的檢測結(jié)果的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明精子活力大小和精子正常形態(tài)率高低對SCSA與SCD檢測精子DFI結(jié)果的差異沒有太大的影響，SCSA與SCD檢測精子DFI的結(jié)果均有明顯差異，而且其差異具有一定的相關(guān)性。

由于兩種方法具有顯著的相關(guān)性，因而各醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以根據(jù)自身的實際情況選擇合適的檢測方法。由于兩種方法的均值具有差異性，建議在實際工作的過程中，SCSA與SCD應(yīng)當(dāng)分別劃定各自的醫(yī)學(xué)參考值范圍供臨床醫(yī)生參考。

近年來，越來越多的研究指出，精子DFI或許比精液常規(guī)檢查能更準(zhǔn)確地預(yù)測男方的生育能力，從而為臨床醫(yī)生的診療提供更有效的數(shù)據(jù)[12]。在實際臨床中研究發(fā)現(xiàn)[13]，在行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization, IVF）治療時，由于在形成受精卵過程中，卵子對可接受受精的精子具有選擇作用，從而避免了DFI很高的精子進(jìn)入卵子內(nèi)，確保了妊娠的質(zhì)量，因此DFI的升高對妊娠結(jié)局的影響并不明顯。據(jù)2014年的一篇Meta分析[14]報道，DFI增高的患者經(jīng)IVF治療時，妊娠率會有所下降。但此類患者經(jīng)ICSI治療后的妊娠率并無明顯變化，而流產(chǎn)率則會增加。同樣，2017年林峰等[15]的一篇Meta分析也同樣印證了此類結(jié)果。上述的研究均說明了高DFI的精子在正常情況下很難與卵子結(jié)合，但由于ICSI是在人工干預(yù)下將某一精子注入卵母細(xì)胞漿內(nèi)，而實驗人員在操作時無法避開DNA受損的精子。一旦選擇的精子有異常，則會影響胚胎的質(zhì)量，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的概率增加。

近幾年，DFI在男科學(xué)領(lǐng)域中已成為研究的熱點問題，其在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要性也日趨增加。受到實驗原理、儀器設(shè)備、操作者的規(guī)范程度和熟練程度等因素的影響，SCSA與SCD兩種檢測精子DFI的方法所得出的結(jié)果并不完全一致。在臨床診療中，醫(yī)生應(yīng)根據(jù)兩種檢測方法的特點對于DFI的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，為患者提供更加個性化的診療方案。