姚立山 郝滿霞

(鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院南陽中心醫(yī)院中藥科，南陽，473009)

在國家藥品評價抽樣、常規(guī)藥材市場調(diào)研進(jìn)行薄荷藥材的抽檢考察中發(fā)現(xiàn)，薄荷存在同科的留蘭香代用或者混用的情況[1-3];逍遙丸的主要適應(yīng)證是肝郁氣滯及脾虛血虛的患者，其出處為宋代《太平惠民和劑局方》，方中以柴胡疏肝解郁，恢復(fù)肝臟條達(dá)、疏泄之性，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝濡養(yǎng)肝臟，增強(qiáng)其藏血之功；白術(shù)、茯苓健脾去濕，后天之本得以鞏固，患者神疲癥狀減輕，《靈樞·平人絕谷篇》有云：“神者，水谷之精氣也”。脾運化有權(quán)，統(tǒng)氣血有司，脾土養(yǎng)肝，緩肝氣橫逆之脅痛；炙甘草甘以緩急，合生姜共奏有益氣補中之效；薄荷少許，助瀉肝郁之熱[4-5]。而目前由于現(xiàn)代中青年工作壓力較大，以及老齡化人口的日益增加，普遍存在肝郁氣滯、脾虛血虛的情況，因此大眾對于服用逍遙丸，疏肝健脾，養(yǎng)血和血的需求較大[6-8]；因此，薄荷作為逍遙丸中重要的藥材之一，控制好逍遙丸的質(zhì)量，預(yù)防在逍遙丸制作完成之前的基礎(chǔ)藥材存在摻偽的情況，尤其關(guān)鍵。薄荷和留蘭香屬于同科同屬的植物，兩者均屬于唇形科植物，性狀相近，因此無法在顯微鏡下鑒別[9]；然而兩者的主要成分和主治功效卻大相徑庭，薄荷主要成分是薄荷腦，主要功效為疏肝行氣，瀉肝郁之熱[10]；而留蘭香的主要成分是香芹酮，主要功效為解表和中[11]。目前薄荷藥材的檢查項中沒有香芹酮的檢查項，比較不容易發(fā)現(xiàn)藥材本身是否存在摻偽的問題，故本研究采集3個不同廠家各2個不同批次的逍遙丸進(jìn)行檢驗，以薄荷腦和香芹酮為對照品，旨在采用指紋圖譜分析逍遙丸的同時，建立其摻偽檢驗方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 氣相色譜儀(型號:7890 A，AGILENT安捷倫科技有限公司);全自動智能內(nèi)校分析天平(型號:PTY124，福州普力斯特科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑 由中國食品藥品檢定研究院提供的批號為0728-200005薄荷腦；由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH研究所提供的批號為00610的香芹酮；以及分析純購于Fisher scientific公司。

1.3 分析樣品 取3個不同廠家(A廠家:仲景宛西制藥股份有限公司;批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z41021831;B廠家:九芝堂股份有限公司;批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z43020469;C廠家:蘭州佛慈制藥股份有限公司;批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z62020890)的逍遙丸，每個廠家各取2批不同生產(chǎn)批次的逍遙丸用研磨器研細(xì),精密取2 g逍遙丸粉末。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

為進(jìn)行摻偽檢驗方法建立，采用2種色譜方法進(jìn)行檢測，具體如下。

2.1.1 氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS法) 采用質(zhì)譜檢測器，EI源，同時選用5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷固定液(HP-5MS)毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，毛細(xì)管柱的進(jìn)樣口溫度為200 ℃；柱溫為程序升溫，具體升溫程序為初始溫度90 ℃，以3 ℃/min升溫至246 ℃，以30 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min，最后以FID檢測器溫度為300 ℃，全掃描方式，m/z 20～1 000，柱流量1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流。

2.2.2 氣相色譜法(GC) 采用DM-5(5%二苯基95%-二甲基聚硅氧烷固定液)毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×1.5 μm)，其進(jìn)樣口溫度200 ℃，程序升溫(同2.2.1)，柱流量3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取薄荷腦和香芹酮對照品，分別加分析純(乙酸乙酯)制成每毫升含50 μg的對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取逍遙丸粉末0.5 g，加入200 mL水的揮發(fā)油測定容器中，充分搖勻，待粉末完全溶于水后加入2 mL分析純(乙酸乙酯)，參照《中華人民共和國藥典2010版一部附錄XD》[12]中揮發(fā)油測定的方法使揮發(fā)油測定容器保持微沸狀態(tài)2 h，取乙酸乙酯層作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液各5 μL，采用薄層層析方法(TLC)對逍遙丸進(jìn)行專屬性試驗，分別點與同一片硅膠G薄層色譜板，展開劑的配比為19環(huán)乙烷：1乙酸乙酯，經(jīng)過展開后，取出硅膠G薄層色譜板并晾干，隨即將含有2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液噴在色譜板上，加熱100 ℃，5 min后將色譜板放置于365 nm的紫外光燈下觀察，專屬性試驗結(jié)果顯示逍遙丸的專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液3、6、12、18、24 mL，分別置50 mL量瓶中，記錄峰面積；以混合對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，薄荷和香芹酮混合對照品溶液在0.060 21～0.113 48 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對標(biāo)注偏差RSD是0.91%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進(jìn)樣檢測，結(jié)果顯示48 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD是0.94%。

2.8 重復(fù)性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同分析儀上檢測5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.90%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品溶液，進(jìn)行回收率試驗測定，計算結(jié)果顯示平均回收率為99.35%，RSD為0.86%。

2.10 樣品測定結(jié)果

2.10.1 GC色譜圖 如圖1顯示A廠逍遙丸供試品中未檢出香芹酮，而B、C廠均檢測出含有香芹酮，且C廠香芹酮PA值高于B廠。

2.10.2 逍遙丸GC-MS色譜圖 根據(jù)GC-MS色譜圖，采用正離子方式掃描，結(jié)果顯示，薄荷腦和香芹酮的GC-MS特征離子峰分別是m/z 41、55、71、81、95和m/z 39、54、82、93、108。見圖2。

表1 逍遙丸中薄荷腦和香芹酮含量測定(mg/g)

3 討論

3.1 摻偽方法建立的必要性 市場上售賣的薄荷藥材處理方式都是揉碎薄荷葉子，因此單純從藥材性狀上很難和同科同屬的留蘭香進(jìn)行顯微鑒別[13]，根據(jù)薄荷和留蘭香的主要成分不同，薄荷主要成分為薄荷腦，并不含有香芹酮[14]，因此本研究首先通過薄層層析法(TLC)對薄荷腦和香芹酮進(jìn)行專屬性試驗，進(jìn)行直接鑒別。當(dāng)通過TLC明確薄荷腦和香芹酮的專屬性后，根據(jù)《中華人民共和國藥典》附錄規(guī)定薄荷和留蘭香屬于同科同屬植物，在種植的時候容易混入，因此允許的雜質(zhì)最高限度是5%[15]，研究進(jìn)一步采用GC法對逍遙丸中薄荷腦和香芹酮進(jìn)行成分指紋圖譜分析，結(jié)果顯示A廠未檢測出香芹酮，而B、C廠均檢測出程度不等的香芹酮含量。為了進(jìn)一步確證，研究采用GC-MS法進(jìn)步對逍遙丸進(jìn)行指紋圖譜分析，在GC-MS質(zhì)譜圖中，與對照品色譜比較，供試品色譜圖不可以出現(xiàn)保留時間相同的色譜峰;若出現(xiàn)保留時間相同的色譜峰，則其一級質(zhì)譜不得與對照品的一級質(zhì)譜一致[16-18]。

3.2 展開劑和顯色劑的選擇 在專屬性試驗TLC法中展開劑和顯色劑的選擇尤為重要，其中展開劑的選擇能夠更好的讓目標(biāo)成分更好的與周圍的干擾斑點分開[19]，在本研究的前期試驗中曾采用甲苯-乙酸乙酯(19∶ 1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(10∶ 1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(10∶ 2)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)為展開劑，結(jié)果選用環(huán)己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)色譜效果最理想，香芹酮與周圍干擾的斑點可以分開。

而由于薄荷和留蘭香是同科同屬植物，薄荷藥材中與香芹酮Rf值相近的位置斑點顏色與香芹酮類似，可能會引起誤判，研究前期試驗中曾使用5%香草醛硫酸溶液作為顯色劑[20]，置熒光下檢視，未能將香芹酮斑點與周圍干擾斑點明確區(qū)分開，而采用2%對二甲氨基苯甲醛作為顯色劑時香芹酮斑點顏色與周圍斑點顏色明顯有區(qū)別。

圖1 逍遙丸GC色譜圖

注：1為薄荷腦；2為香芹酮

圖2 逍遙丸GC-MS色譜圖

3.3 毛細(xì)管柱的選擇 采用氣相色譜儀分析逍遙丸指紋圖譜中GC法和GC-MS法中毛細(xì)管柱的選擇尤其重要，其耐用性決定后續(xù)中精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和結(jié)果可靠性的關(guān)鍵因素[21-23]，在GC法中選擇DM-5(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛細(xì)管柱和在GC-MS法中選擇HP-5MS(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛細(xì)管柱，2種毛細(xì)管柱均具有良好的分離度和塔板數(shù)，表明本研究中逍遙丸指紋圖譜選用的毛細(xì)管柱耐用性良好。

3.4 方法嚴(yán)謹(jǐn)性考察意義 指紋圖譜中線性考察的意義在于分析樣品在某一個濃度或峰高(面積)情況是否是成線性的,根據(jù)朗伯比爾定律，待測樣品面積與濃度在這個線性范圍內(nèi)成正比，分析結(jié)果才是準(zhǔn)確的[24]。而加樣回收率包括絕對回收率和相對回收率,其中相對回收率有一種是回收試驗法,另一種是加樣回收試驗法[25]。而本研究的目的主要是為了考察指紋圖譜檢測方法的嚴(yán)謹(jǐn)性,因此需要分析相對回收率，故而選用加樣回收試驗法,即在已知濃度樣品中加入藥物,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。