王 敏 馬全濤 李亞琪 柳辰玥 張 馳 邱敏懿 張彩娟 王 停 趙保勝 李紅燕

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，102488； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)/北京中醫(yī)藥研究院，北京，10029； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京，100029)

糖尿病是由于遺傳或環(huán)境等多種因素引起機(jī)體胰島素分泌量相對(duì)或絕對(duì)減少，導(dǎo)致糖類、脂類及蛋白質(zhì)類等物質(zhì)代謝紊亂而產(chǎn)生的慢性疾病。城市化，老齡化以及人民生活節(jié)奏的加快使糖尿病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。最新報(bào)告顯示，中國(guó)成年人中約有1.14億糖尿病患者，發(fā)病率高達(dá)10.4%，其中約90%為2型糖尿病(T2DM)，糖尿病已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的非傳染性疾病之一[1]。

T2DM的發(fā)病機(jī)制暫無定論，其主要病理特征之一為胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)。IR即胰島素調(diào)控葡萄糖代謝的生物學(xué)效應(yīng)降低，機(jī)體代償性分泌胰島素以維持血糖穩(wěn)定，貫穿于T2DM的全過程[2]。肝臟是胰島素作用的主要器官，也是發(fā)生IR的重要場(chǎng)所[3]。IR的發(fā)生與諸多因素有關(guān)，炎性反應(yīng)是其中之一[4]。炎性反應(yīng)是人體的重要防御機(jī)制，機(jī)體遭受侵襲后，激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)以及C反應(yīng)蛋白(C-reactive Protein,CRP)等炎性反應(yīng)遞質(zhì)進(jìn)行自我保護(hù)。Toll樣受體(Toll-like Receptors,TLRs)是免疫應(yīng)答中重要的模式識(shí)別受體，其與配體結(jié)合后，可通過髓樣分化因子(Myeloid Differentiation Factor 88,MyD88)依賴性信號(hào)途徑或MyD88非依賴性信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活核因子-B，誘導(dǎo)分泌炎性反應(yīng)遞質(zhì)[5]，干擾胰島素信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致或加重IR[6]。

桑葉為?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉，味苦、甘，性寒，歸肺、肝經(jīng)，有疏風(fēng)散熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目之效，為臨床常用中藥，其用于糖尿病的治療最早載于《本草綱目》，言曰:“桑葉……明目長(zhǎng)發(fā)，止消渴”。中醫(yī)“消渴證”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)糖尿病特征相似[7]。臨床研究表明，桑葉及其配方治療T2DM藥效顯著[8-9]，對(duì)T2DM并發(fā)癥亦有一定的防治作用[10-11]。桑葉體內(nèi)含有生物堿、黃酮以及多糖[12-13]，可通過抑制葡萄糖吸收[14]，抑制B細(xì)胞凋亡[15]，改善PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑實(shí)現(xiàn)降糖作用[16]。同時(shí)有報(bào)道桑葉可以通過抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)的表達(dá)而降低血糖[17]，但是桑葉抗炎降糖的作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桑葉可降低自發(fā)性糖尿病模型KKAy小鼠胰腺組織中TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)[18]，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中又發(fā)現(xiàn)桑葉可降低T2DM小鼠肝臟組織中TLR7、TLR8、TLR9的表達(dá)[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究桑葉對(duì)TLRs受體及其下游信號(hào)元件表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，體重180～200 g，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0038。

1.1.2 藥物 桑葉(經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉)，由北京仟草中藥飲片有限公司提供；二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：AAT8173)。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma，批號(hào)：WXBB6772V)；穩(wěn)豪ONE TOUCH血糖試紙[強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司，批號(hào)：4002886]；無水葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110104)；生物合成人胰島素注射液[諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司，批號(hào)：EVG4950]；大鼠ELISA胰島素試劑盒(美國(guó)ALPCO，批號(hào)：04857)；大鼠ELISA TNF-試劑盒(美國(guó)Life Technologies，批號(hào)：1818268A)；大鼠ELISA IL-6試劑盒(美國(guó)Life Technologies，批號(hào)：1780090B)；大鼠ELISA CRP試劑盒(美國(guó)Life Technologies，批號(hào)：0739103116)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen，批號(hào)：15596)；cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific，批號(hào)：00279105)；SYBR Green試劑盒(Applied Biosystems，批號(hào)：1508501)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific)；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)；Biofuge Primo型離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只為正常組，維持飼料喂養(yǎng)，其余大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周后，禁食14 h，腹腔注射1%STZ檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L，pH 4.2～4.5，4 ℃)，劑量為20 mg/kg體重，正常對(duì)照組僅腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。注射后第7天剪尾采血，測(cè)定大鼠空腹血糖，血糖值大于12 mmol/L即視為造模成功。大鼠按空腹血糖值隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍(0.2 g/kg)組、桑葉高劑量(3 g/kg)組和桑葉低劑量(1 g/kg)組，每組12只。

1.2.2 給藥方法 稱取桑葉5 kg，加10倍質(zhì)量的去離子水，85 ℃煎煮10 h，加熱回流90 min，過濾，濃縮至相當(dāng)于生藥量3.75 mg/mL。灌胃給藥,1次/d，連續(xù)12周，正常組和模型組給予等量動(dòng)物飲用水。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)一般指標(biāo)檢測(cè)：每周測(cè)定大鼠體重及24 h內(nèi)進(jìn)食量和飲水量各1次，給藥11周各組禁食不禁水12 h后進(jìn)行空腹葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)，灌胃給藥,1 g/kg葡萄糖溶液，測(cè)定0、15、30、60、90、120 min內(nèi)各組血糖值。給藥第12周禁食不禁水12 h后進(jìn)行胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)，灌胃給藥，75 U/kg胰島素，測(cè)定0、15、30、60、90、120 min各組血糖值。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食14 h后，腹主動(dòng)脈取血，低溫離心取血清，根據(jù)試劑盒說明書要求測(cè)定血清中胰島素、TNF-、IL-6、CRP水平。2)TLR7、TLR8、TLR9、MyD88、TRAF-6、NF-B mRNA的水平測(cè)定：大鼠麻醉后取肝臟最大葉，-80 ℃保存。Trizol法提取肝臟組織總RNA，核酸蛋白紫外分光儀檢測(cè)RNA濃度及完整性。NCBI數(shù)據(jù)庫查詢大鼠RNA總序列并設(shè)計(jì)引物，引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。各引物序列如下：

β-actin上游5-CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG-3，下游5-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3，TLR7上游5-GTGTGCACCAAGAGGCTACA-3，下游5-TGGCCCAGGTAGAGTAGATTC-3，TLR8上游5-CTGTGGAATGCAAATGATGG-3，下游5-TCATTTCTCCCCAAGTCCAG-3，TLR9上游5-TGCAGGAGCTGAACATGAAC-3，下游5-ATTGGACAGGTCCACAAAG C-3，MyD88上游5-GTGGTGGTTGTTCTGACGAT-3，下游5-CGCAGATAGTGATGAACCGTAG-3，TRAF-6上游5-CATTGTGAATTCGCTCTAGTGA-3，下游5-GGACAGCTTTGATCGTGGA-3，核因子-B上游5-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3,下游5-TCCGGAACACAATGGCCAC-3。按照SYBR Green試劑盒要求，使用PCR擴(kuò)增儀，于20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本設(shè)定2個(gè)平行孔，取其均數(shù)計(jì)算CT值，按照如下Pfaffl公式計(jì)算目的基因表達(dá)量[20]。

Ratio=(Etarget)△CT,target(calibrator-test)/(Eref)△CT ref(calibrator-test)

△CTtarget(calibrator-test)=(CTtarget)A549-(CTtarget)A549PTX

△CTref(calibrator-test)=(CTref)A549-(CTref)A549PTX

其中Etarget、Eref分別為目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。

2 結(jié)果

2.1 5組T2DM大鼠體重及飲水進(jìn)食比較 實(shí)驗(yàn)中，部分大鼠在實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)了低血糖死亡，所以最終統(tǒng)計(jì)的動(dòng)物數(shù)量出現(xiàn)了差異。由于桑葉起效較慢，前期大鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化不明顯，因此僅列出第12周的數(shù)據(jù)。與正常對(duì)照組比較，模型組體重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血糖值、飲水量和進(jìn)食量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組血糖和進(jìn)食、飲水量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但體重變化不明顯；桑葉組血糖和飲水量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但體重和進(jìn)食量變化不明顯。見表1。

2.2 5組T2DM大鼠糖耐量和胰島素耐量比較 第11周，與正常對(duì)照組比較，模型組出現(xiàn)明顯的糖耐量異常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，曲線下面積高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組糖耐量改善明顯，曲線下面積縮小明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，桑葉高劑量組90 min和120 min時(shí)血糖值明顯降低，曲線下面積出現(xiàn)明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 5組T2DM大鼠血清胰島素含量及胰島素耐量比較 注射胰島素后，與正常組對(duì)照比較，模型組為明顯的胰島素耐量異常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AUC明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其空腹胰島素含量明顯升高，胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和桑葉高劑量組AUC顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清胰島素含量明顯下降，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4。

表1 5組T2DM大鼠體重及飲水進(jìn)食比較

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,*P<0.05

表2 5組T2DM大鼠糖耐量和胰島素耐量比較

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

表3 5組T2DM大鼠ITT比較(第11周)

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

表4 5組T2DM大鼠胰島素水平比較

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

2.4 5組T2DM大鼠血清炎性反應(yīng)遞質(zhì)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組血清中IL-6、TNF-和CRP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：與模型組比較，二甲雙胍可以明顯降低IL-6、TNF-和CRP水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；桑葉組IL-6和CRP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNF-有一定的降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 5組T2DM大鼠血清炎性反應(yīng)遞質(zhì)比較

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

2.5 5組T2DM大鼠肝臟TLRs及其下游信號(hào)元件mRNA比較 與正常對(duì)照組比較，模型組TLR7、TLR8、TLR9及TRAF-6、MyD88、核因子-B表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍、桑葉高劑量可以明顯降低TLRs受體及其下游信號(hào)蛋白的基因表達(dá)量，桑葉低劑量可以明顯降低TLRs受體及其下游信號(hào)蛋白的基因表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

3 討論

T2DM是以高胰島素血癥和胰島素抵抗為特征的非傳染性疾病。患者多有飲食不節(jié)，過食肥膩，好逸惡勞之惡習(xí)，中醫(yī)學(xué)將之列入“消渴”的范疇，中醫(yī)認(rèn)為“消渴癥”的病機(jī)為陰虛燥熱或兼有痰濕血瘀證，治療以益氣養(yǎng)陰清熱藥為主，或配伍以化痰祛瘀藥。桑葉味甘性寒，甘以養(yǎng)陰，寒以涼血，兼有清、潤(rùn)之效，臨床常用于治療陰虛內(nèi)熱型消渴[21]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察桑葉對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射制備T2DM大鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)桑葉可以有效降低大鼠空腹血糖值、飲水量，改善T2DM大鼠OGTT和ITT，同時(shí)發(fā)現(xiàn)桑葉可以降低HOMA-IR，說明桑葉可以改善T2DM大鼠胰島素抵抗。

桑葉可以降低T2DM大鼠血清中IL-6、TNF-、CRP的水平，提示桑葉改善胰島素抵抗，治療T2DM，可能是通過降低炎性反應(yīng)水平來實(shí)現(xiàn)的。研究顯示，相較于未患病者，T2DM患者體內(nèi)IL-6、TNF-和CRP水平明顯升高，說明T2DM患者體內(nèi)存在炎性反應(yīng)[22]。有學(xué)者認(rèn)為，T2DM是機(jī)體非特異免疫產(chǎn)生的慢性炎性反應(yīng)[23]。炎性反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激產(chǎn)生的防御機(jī)制，機(jī)體受到病毒、抗原等刺激時(shí)，免疫細(xì)胞被激活，可分泌IL-6、TNF-和CRP來進(jìn)行自我保護(hù)。IL-6主要由脂肪組織分泌，肝臟也是其分泌的重要部位，正常生理狀態(tài)下，IL-6有利于肝糖代謝，T2DM患者體內(nèi)脂肪代謝紊亂，身體長(zhǎng)期處于慢性炎性反應(yīng)浸潤(rùn)狀態(tài)下，長(zhǎng)期過量分泌的IL-6可導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能損傷，產(chǎn)生IR[24]。TNF-具有多種生物學(xué)活性，可以誘導(dǎo)IL-6等多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)的分泌，在T2DM過程中，可直接作用于胰島B細(xì)胞，抑制胰島素分泌或者通過抑制胰島素受體信號(hào)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致或者加重IR[25]。CRP為非特異性免疫的炎性標(biāo)志物，是預(yù)測(cè)T2DM發(fā)病的危險(xiǎn)因子，其在TNF-和IL-6等炎性反應(yīng)遞質(zhì)的刺激下由肝臟產(chǎn)生分泌，可以通過抑制胰島素受體酪氨酸激酶加重IR[26]。本實(shí)驗(yàn)中在前期實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)桑葉不僅可以降低糖尿病大鼠肝臟組織TLRs的表達(dá)，同時(shí)還可以下調(diào)其下游信號(hào)元件TRAF-6、MyD88以及核因子-B的相對(duì)表達(dá)。

表6 5組T2DM大鼠肝臟TLRs及其下游信號(hào)元件mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路在炎性反應(yīng)中具有重要作用，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)13個(gè)具有功能的TLRs，其中TLR1～TLR9為人鼠共有。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，主要分為胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)域3部分，胞外域因與白細(xì)胞介素-1受體序列高度相似，被稱作Toll/IL-1(TIR)結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。TLRs介導(dǎo)的信號(hào)途徑主要為兩類：一類是MyD88依賴性通路：MyD88活化后與IRAKs結(jié)合，活化后的IRAKs與TRAF6磷酸化，并與MyD88解離。TRAF6在與Ubc13/Uevl A催化下發(fā)生泛素化，泛素化后的TRAF6激活TAK1，引起IKK復(fù)合物磷酸化，促使I-B磷酸化，并與核因子-B解離，核因子-B進(jìn)入細(xì)胞核，激活炎性反應(yīng)基因，誘使其表達(dá)。TLR5、TLR 7、TLR 8、TLR9與配體識(shí)別后可以直接激活MyD88，TLR2和TLR在與Mal蛋白結(jié)合后再識(shí)別MyD88[28]。另一類是非MyD88依賴性通路，由TLR3、TLR4、TLR5激活[29]，間接促進(jìn)核因子-B的表達(dá)，刺激炎性反應(yīng)遞質(zhì)分泌。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上利用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)對(duì)桑葉干預(yù)后糖尿病大鼠肝臟組織進(jìn)行檢測(cè)，其TLR7、TLR 8、TLR9以及其下游信號(hào)通路中MyD88、TRAF6、核因子-B mRNA表達(dá)，均出現(xiàn)了不同程度的下降，因此，桑葉可能是通過抑制TLRs及其下游信號(hào)元件表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)，發(fā)揮降糖作用。