劉勁松 林 哲 鄭燕姣

(湖南省中醫(yī)院研究院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，長沙，410006)

腎間質(zhì)纖維化是諸多腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的共同病理過程[1-3]，腎纖維化的發(fā)生提示腎功能惡化，因此深入研究腎纖維化的機制，探索有效的干預措施抑制腎纖維化過程是減少諸多腎臟疾病和延緩其病情發(fā)展的關(guān)鍵。腎纖維化屬于中醫(yī)學“水腫”“關(guān)格”“虛勞”等范疇，歷代醫(yī)家認為腎纖維化過程中素體正氣逐漸虛損，邪毒日漸瘀滯，長期的正邪相爭后形成邪盛正虛的病理變化[4-6]。近年來中草藥以其毒性低、療效顯著等優(yōu)勢被眾多科研工作者納入研究。腎復康是我院經(jīng)驗方，由土黃芪、太子參、生地黃、山茱萸、茯苓、白花蛇舌草、蟬花、丹參、大黃等藥物組成，有顯著的健脾補腎、瀉濁排毒的作用，本研究嘗試通過HE染色實驗、免疫組化實驗、Western blotting檢測，觀察腎復康對腎纖維化模型大鼠的影響，旨在為中醫(yī)防治腎纖維化提供新思路及實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級SD大鼠70只，雌雄各半，體重(200±20)g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號為№3567824。飼養(yǎng)條件：溫度(23±1)°C，濕度(50±1)%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2 藥物 腎復康(生黃芪30 g、太子參15 g、生地黃15 g、山茱萸15 g、茯苓15 g、白花蛇舌草30 g、忍冬藤30 g、蟬花15 g、丹參15 g、大黃8 g)，由湖南省中醫(yī)藥研究院中心藥房提供。

1.1.3 試劑與儀器 24 UP測試盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號20170819)、SCr測試盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號20179812)、BUN測試盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號20170521)，TGF-β1一抗(美國CST生物公司,型號：BY-3283R)，Smad2(美國CST生物公司,型號：BY-3551R)、Smad7(美國CST生物公司,型號：BY-3526R)。4%多聚甲醛溶液(上海西塘生物試劑有限公司)，蘇木精-伊紅(HE)(上海西塘生物試劑有限公司)，鹽酸溶液(上海西塘生物試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)分組：于實驗條件下適應環(huán)境3 d后，隨機挑選10只作為假手術(shù)組，其余大鼠禁食12 h后進行造模，造模成功后隨機分為腎復康組(低劑量組15只、中劑量組15只及高劑量組15只)及模型組(15只)[7]。各組在性別、體重、鼠齡等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2)模型制備：將大鼠進行禁食不禁水12 h后利用10%水合氯醛以0.3 mL/kg的劑量進行麻醉，造模過程根據(jù)大鼠的麻醉情況可適當補充水合氯醛，充分麻醉后將大鼠以右側(cè)臥位的體位固定于手術(shù)臺上，將左側(cè)腹部皮毛剔除，露出手術(shù)部分，利用75%乙醇常規(guī)消毒后從背部距左側(cè)肋脊角1.5 cm處做一長約2 cm的斜切口，用分離鉗將皮膚肌肉逐層鈍性分離，直至將左側(cè)腎臟充分暴露，隨后將左側(cè)輸尿管鈍性分離暴露，并在近腎門處和輸尿管上1/3處進行雙重結(jié)扎，最后將左側(cè)腎臟回納原位后逐層縫合。

1.2.2 干預方法 1)給藥劑量：根據(jù)成人與大鼠用藥劑量換算法腎復康制作成水平4.58、9.16、18.32 g/(kg·d)進行灌胃。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛，2～3 mL/kg腹腔麻醉。模型組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸L尿管但不結(jié)扎，腎復康組、模型組在造模成功后，動物清醒1 h后灌胃給藥。假手術(shù)組(4 mL蒸餾水灌胃)、模型組(4 mL蒸餾水灌胃)，腎復康組，各組造模后每日灌胃2次，時間分別為9：00和15：00，連續(xù)21 d，直到處死為止。

1.2.3 檢測指標與方法 1)24 UP、SCr、BUN水平:處死前1 d收集各組籠內(nèi)24 h尿液，根據(jù)相關(guān)的試劑盒說明書進行24 UP、SCr、BUN水平的檢測。2)腎臟組織病理學觀察：各組隨機選取3只大鼠，將左腎取出后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并按說明書進行脫水、石蠟包埋，隨后將蠟塊進行修切后制成4 μm厚度的切片，并將切片進行蘇木精-伊紅染色，隨后用顯微鏡觀察各組左腎組織的染色結(jié)果。參參考文獻[8]對結(jié)果進行評分，0分為腎臟組織未見病理性改變；1分為腎臟組織出現(xiàn)輕度腎小管擴張、萎縮或壞死，病變范圍≤1/4；2分為腎臟組織出現(xiàn)中度腎小管擴張、萎縮或壞死，1/4<病變范圍≤1/2；3分為腎臟組織出現(xiàn)中度腎小管擴張、萎縮或壞死，病變范圍>1/2。每個切片隨機選取5個視野，取平均值作為最終結(jié)果。3)用Western blotting檢測Smad2 Smad7和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)水平：各組隨機選取3只大鼠，剪取左腎組織約100 mg，加入裂解液充分裂解組織，將溶液高速離心(4 ℃,1 000 r/min)15 min，抽取上清液進行蛋白定量，并根據(jù)相應的蛋白水平計算上樣量。將各組標本溶液于金屬浴鍋100 ℃條件下變性10 min，按照碧云天膠體配制說明書事先配制電泳膠體，加入樣本后進行電泳，后進行轉(zhuǎn)膜、染色、封閉蛋白，最后將反應膜置于化學發(fā)光成像儀上，加入ECL發(fā)光液顯影，隨后進行A值讀取。4)免疫組化檢測TGF-β1水平：各組隨機選取3只大鼠，將左腎取出后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，并按說明書進行脫水、石蠟包埋，隨后將蠟塊進行修切后制成4 μm厚度的切片，將切片經(jīng)過新鮮二甲苯、梯度乙醇、自來水、磷酸鹽緩沖液(PBS)分別沖洗后將切片置于抗原修復液中進行修復，隨后加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，充分反應后連續(xù)使用PBS浸洗，后加入非特異性染色阻斷劑后加入1∶ 1 000配制的TGF-β1抗體，將反應物置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育24 h，隨后再次用PBS浸洗，最后用自來水浸洗去除切片表面的PBS，用二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)進行顯色后用蘇木精染色，隨之自來水沖洗、返藍、乙醇、二甲苯浸泡后用中性樹脂封片，最后在光鏡下讀片。

表1 5組24 UP、SCr、BUN比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2 結(jié)果

2.1 5組24 UP、SCr、BUN比較 與假手術(shù)組比較，腎復康組及模型對照組24 UP、SCr及BUN水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，腎復康組24 UP、SCr及BUN水平有所下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著腎復康劑量升高趨勢更明顯。見表1。

2.2 5組腎臟組織病理學比較 與假手術(shù)組比較，腎復康組及模型組腎組織病理評分均明顯升高，其中腎復康組評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著腎復康劑量的增加病理評分逐漸下降。見表2。

2.3 5組TGF-β1、Smad2 Smad7比較 假手術(shù)組腎組織僅有少量TGF-β1、Smad2表達，模型組Smad2、TGF-β1呈高表達，隨著腎復康水平的增加Smad2、TGF-β1水平逐漸下降。造模后Smad7水平下降，腎復康干預后Smad7水平有所上調(diào)，并隨著水平的增加而上調(diào)趨勢更明顯。見表3～4及圖1。

表2 5組腎臟組織病理學比較分)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表3 5組TGF-β1陽性細胞數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表4 5組Smad2、Smad7/內(nèi)參(IOD比值)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖1 5組Smad2、Smad7蛋白表達

3 討論

古代醫(yī)學書籍并無“腎纖維化”這一說法，結(jié)合該病的臨床癥狀認為其屬于“水腫”“關(guān)格”“虛勞”等范疇。此病與脾腎兩臟關(guān)系密切，脾腎分清泌濁能力是否正常是關(guān)于本病是否發(fā)生的關(guān)鍵，而脾腎的分清泌濁能力有賴于氣化而進行。機體中肺、脾、肝等功能的異常均可影響氣化，腎氣虧虛更是氣化異常的根本，氣化不足則機體分清泌濁障礙，則水液、毒物無法及時轉(zhuǎn)輸及運化，從而產(chǎn)生了濕濁、血瘀等病理產(chǎn)物[7-8]。有臨床資料顯示，腎纖維化是形成是一個漫長的、難治的過程，久病必虛，隨著正氣逐漸耗損，邪毒瘀積漸盛，正邪相爭后致邪盛正虛，故腎纖維化形成的各個階段均以正氣虛損為主，瘀血形成為標[9-12]?；诖擞醒芯咳藛T對治療腎纖維化的中藥復方進行數(shù)據(jù)挖掘分析，結(jié)果顯示補益藥使用頻率占首位，隨之是活血化瘀藥及清熱藥[13]。在單味藥使用總結(jié)中發(fā)現(xiàn)黃芪是使用頻率最高的中藥，依次是大黃、當歸、丹參、川芎、牛膝、山藥?？梢娬驗榇嬖凇罢摗保恃a益藥占據(jù)比例最大，而本研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥使用頻率僅次于補益類藥物，因此我們認為活血化瘀亦應是治療腎纖維化的基本方法。本研究所使用腎復康由我院腎病專家肖德才教授根據(jù)腎臟病中醫(yī)病因、病機，總結(jié)幾十年臨床經(jīng)驗所創(chuàng)立。方中黃芪、太子參有益氣之功，生地黃、山茱萸以及茯苓可加強健脾功效，且有補腎作用；現(xiàn)代藥理學研究顯示黃芪可明顯增強機體免疫能力，而山茱萸可明顯改善腎小球濾過功能。白花蛇舌草、忍冬藤、蟬花、大黃、丹參具有清熱瀉濁、排毒化瘀的功效，現(xiàn)代藥理學證實白花蛇舌草、大黃等提取物有明顯消炎效應，并可顯著降低肌酐改善腎功能。腎復康藥物配伍共奏健脾益腎，泄?jié)崤哦?，充分體現(xiàn)辨證施治的特點[14]。前期研究已證實，腎復康可明顯改善原發(fā)性膜性腎病患者的臨床癥狀，減少尿蛋白，提高機體免疫[15]。本研究觀察了5組腎組織病理學改變，其中假手術(shù)組并未出現(xiàn)明顯異常，而造模組出現(xiàn)了不同程度腎小管擴張、萎縮或壞死，其中腎復康組隨著水平的升高病情逐漸改善，并且大鼠的腎功能亦有了明顯改善，這證實了腎復康確可在一定程度改善腎功能。

在對作用機制的研究中我們對各組的腎臟組織的TGF-β1/Smad信號通路進行檢測，機體具有多種因子可導致腎纖維化，各種致纖維化因子之間亦存在復雜的關(guān)系，TGF-β是具有明顯的促進腎纖維化生物學效應[16]，對于腎臟細胞的增殖、分泌、遷移及凋亡過程均有參與[17-19]。Smad是目前認為的細胞內(nèi)唯一存在的TGF-β相應酶激活物，可介導TGF-β的細胞內(nèi)信號傳導，TGF-β1可將細胞膜表面相應的I型受體相結(jié)合，形成復雜的Smad2、Smad3及Smad7等因子，Smad2可誘使生物因子并核移位轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)產(chǎn)生生物效應，Smad7是TGF-β蛋白在信號通路中的負調(diào)控因子，在腎小球及腎小管組織有豐富的表達，TGF-β1/Smad信號通路是著眼腎纖維化的關(guān)鍵[20-21]。研究中假手術(shù)組腎組織僅有少量TGF-β1、Smad2表達，模型組Smad2、TGF-β1高表達，隨著腎復康水平的增加Smad2、TGF-β1水平逐漸下降。造模后Smad7水平下降，腎復康干預后Smad7水平有所上調(diào)，并隨著水平的增加而上調(diào)得趨勢更明顯。這提示腎復康可通過抑制TGF-β對Smads的激活，從而抑制TGFβ/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導，減少腎纖維化程度，且其作用效應具有一定的劑量依賴性。