龍俊科 趙水平

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 長沙 410011）

消瘀降脂膠囊是由丹參和山楂提取物組成的復(fù)方中藥，于2006年取得新藥證書。由丹參水溶性總酚酸和山楂總?cè)扑?個有效成分，按一定比例混合組成。丹參近千年來廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病。丹參水溶性總酚酸是從丹參中提取的各種酚酸類化合物的總和，是丹參主要的有效部位，其成分有：丹參素，迷迭香酸，紫草酸，原紫草酸、丹參酚酸A、B等，早期的藥理實驗充分證明了丹參的某些提取物具有明確的降低血脂作用[1]。山楂是薔薇科山楂屬的植物，為我國的特產(chǎn)果樹。山楂干燥成熟的果實，具有消食、健胃、行氣、散瘀、化濁、降脂等作用，尤其是在消化系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、血脂調(diào)節(jié)、糖代謝等方面均具有較強的藥理作用[2]。前期的研究表明，消瘀降脂膠囊可顯著降低高脂血癥動物血脂水平，具有明顯的治療作用[3]。本研究從預(yù)防的角度出發(fā)，通過高脂血癥兔模型，觀察消瘀降脂膠囊預(yù)防給藥對高脂血癥形成的影響以及藥理作用機制，包括對膽固醇吸收、膽固醇合成、甘油三脂合成、脂蛋白代謝、脂代謝調(diào)控受體等靶點的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭兔，8周，雄性，40只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由長沙天勤生物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）-2014-0010，合格證號：43006700880329；動物自由攝食、飲水；基礎(chǔ)飼料與高脂飼料分別由上海福貝寵物用品有限公司以及北京科澳協(xié)力有限公司提供；動物飼養(yǎng)溫度為23～26℃，相對濕度為50%～60%。

1.2 藥品與試劑 消瘀降脂膠囊（0.25 g/粒，貴陽新天藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)提供，國藥準(zhǔn)字：Z20060427，批號：150502），阿托伐他汀片（20 mg/片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H20051407），生理鹽水配制成各使用濃度。血清甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇 （high density lipoprotein in cholesterol， HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein in cholesterol，LDL-c）測試盒均為日本和光純藥工業(yè)株式會社（wako） 產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫法（Enzyme linked immunosorbent assays，ELISA）測定兔血清、肝臟以及小腸中相關(guān)蛋白或蛋白受體含量；ELISA試劑盒由上海酶連生物科技有限公司提供；組織勻漿液使用BCA法進行蛋白定量，所用試劑盒由上海碧云天生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器 脫色搖床（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠），全自動酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司），手持式勻漿機（杭州米歐儀器有限公司）等、TGL16M低溫離心機（中國）、CD1200全自動生化分析儀（美國）。

1.4 動物造模、分組與給藥 健康雄性新西蘭兔40只，以普通飼料喂養(yǎng)觀察1周后進入實驗，記錄體質(zhì)量和進行基線血脂分析。隨機選為5組，即正常組、模型組、阿托伐他汀組、消瘀降脂膠囊組以及聯(lián)合給藥組，每組8只。其中正常組每日予以120 g/d的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組以高脂飼料120 g/d喂養(yǎng)至第12周。從第2周開始，進行藥物干預(yù)，其中正常組與模型組每日予以30 mL生理鹽水灌胃，阿托伐他汀組每日灌胃給予2 mg/kg阿托伐他汀，消瘀降脂膠囊組每日灌胃給予以100 mg/kg消瘀降脂膠囊，聯(lián)合給藥組則同時給予2 mg/kg的阿托伐他汀以及100 mg/kg的消瘀降脂膠囊，連續(xù)給藥10周，采集血樣，肝臟以及小腸。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 體質(zhì)量 給藥前（0周）和第8周以及第12周時稱取各組新西蘭兔的體質(zhì)量。

1.5.2 血脂水平 采血前，動物均已禁食不禁水12 h以上。第0周時耳緣靜脈采血；第12周時，以戊巴比妥100 mg/kg耳緣靜脈深度麻醉后，股動脈采血。血樣在室溫自然凝固，低溫離心（4℃，3000r/min，離心10min），分離血清，采用全自動生化儀配以相應(yīng)的試劑盒，檢測血清TC、TG、HDL-c以及LDL-c。

1.5.3 血清相關(guān)蛋白酶活性 類似于血脂水平檢測，采血前動物均已禁食不禁水12 h以上。第12周時，以戊巴比妥100 mg/kg耳緣靜脈深度麻醉后，股動脈采血。血樣在室溫自然凝固，低溫離心（4℃，3000 r/min，離心10 min），分離血清，使用ELISA法測定血清LDL-R、Apo-B100、SREBP2以及PCSK9活性。

1.5.4 肝臟相關(guān)蛋白酶活性 第12周時，以戊巴比妥100 mg/kg耳緣靜脈深度麻醉后，取肝組織液氮凍存?zhèn)溆?；臨用前，按照每10 mg組織加100μL的PBS進行組織勻漿；取勻漿液上清，使用BCA法進行蛋白定量，隨后使用ELISA法測定勻漿液中HMGCG、PPAR-γ、LPL以及MTP含量。

1.5.5 小腸相關(guān)蛋白酶活性 第12周時，以戊巴比妥100 mg/kg耳緣靜脈深度麻醉后，取小腸組織液氮凍存?zhèn)溆?；臨用前，按照每10 mg組織加100μL的PBS進行組織勻漿；取勻漿液上清，使用BCA法進行蛋白定量，隨后使用ELISA法測定NPC1L1含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)均使用SPSS 21進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，常規(guī)方差分析后post hoc兩兩比較（方差齊則LSD檢驗，方差不齊則Dunnett’s檢驗）。雙側(cè)檢驗，P〈0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各組實驗兔體質(zhì)量呈生理性增長，各組體質(zhì)量在開始時（0周）、第8周和第12周，組間無顯著差異 （P〉0.05）。

2.2 各組血脂指標(biāo)比較 給藥前10周，各組各項血脂指標(biāo)均無明顯差異（P〉0.05），見表1、2。第12周檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，各組TC、TG以及LDL-c均顯著升高（P〈0.001），提示高血脂造模成功；第12周，與模型組比較，各給藥組的TC和LDL-c水平均顯著降低（P〈0.05），說明消瘀降脂膠囊與阿托伐他汀均可以顯著性地預(yù)防高血脂形成。第12周，與阿托伐他汀組相比，消瘀降脂膠囊組TC、TG、HDL-c以及LDL-c水平均無顯著性差異（P〉0.05），提示在臨床劑量下，阿托伐他汀與消瘀降脂膠囊的預(yù)防降脂藥效相當(dāng)；同時，與阿托伐他汀組相比，第12周，聯(lián)合給藥組的TC以及LDL-c顯著性降低（P〈0.05），見表2。實驗結(jié)果提示，相比于阿托伐他汀單用，消瘀降脂膠囊聯(lián)合用藥可進一步加強預(yù)防新西蘭兔的高血脂形成。

表1 給藥前（0周）血脂基礎(chǔ)水平 （x±s，mmol/L）

表2 給藥10周后血脂水平 （x±s，mmol/L）

2.3 膽固醇吸收相關(guān)酶活性 如圖1所示，與正常組（8350.7±259.1） pg/g相比，模型組動物小腸組織中膽固醇吸收相關(guān)NPC1L1蛋白含量 [（11727.8±356.5） pg/g]顯著升高（P〈0.001）；相比于模型組，各給藥組動物小腸組織中的NPC1L1蛋白含量均有所降低，其中消瘀降脂膠囊組 [（9717.6±455.8） pg/g]以及聯(lián)合給藥組[（7951±668.9） pg/g] 均有顯著性差異 [（9717.6±455.8） vs.（11727.8±356.5），P〈0.01；（7951±668.9）vs.（11727.8±356.5），P〈0.001]。

圖1 各組新西蘭大白兔小腸中NPC1L1蛋白含量

2.4 膽固醇和甘油三脂合成以及水解相關(guān)酶活性 如圖2所示，與正常對照組（60.77±9.60） pg/g相比，模型組動物肝組織中膽固醇合成相關(guān)的HMGCR蛋白含量[（117.21±5.05） pg/g] 顯著升高 （P〈0.001）；與模型組[（117.21±5.05） pg/g] 相比，阿托伐他汀組 [（91.25±7.05） pg/g]、消瘀降脂膠囊組 [（93.56±7.99） pg/g] 以及聯(lián)合給藥組 [（66.82±9.40） pg/g]的動物肝臟HMGCR蛋白含量均顯著性降低 （P〈0.01、P〈0.05以及P〈0.001）；與正常組 [（6.87±0.47） ng/mL]相比，高脂飲食喂養(yǎng)的模型組 [（12.32±0.62） ng/mL]血清中LPL顯著性降低（P〈0.001）；與模型組 [（6.87±0.47） ng/mL] 相比，各給藥組動物的血清LPL水平均有所增加，其中消瘀降脂膠囊組 [（8.83±0.55） ng/mL]以及聯(lián)合給藥組 （11.12±0.39） ng/mL具有顯著性差異 （P〈0.05以及P〈0.001）。

圖2 各組新西蘭大白兔體內(nèi)HMGCR以及LPL蛋白含量

2.5 脂蛋白代謝相關(guān)酶活性 如圖3所示，與正常組的血清[PCSK9 （1064.02±45.81） pg/mL]、Apo-B100[（1055.37±99.94） pg/mL] 以及肝臟MTP[（1439.47±191.70） pg/g]相比，高脂飲食喂養(yǎng)的模型組動物血清PCSK9[（1439.47±191.70） pg/mL]、Apo-B100[（1560.89±187.73） pg/mL]以及肝臟MTP[（9870.54±457.44） pg/g] 的含量均顯著性升高（P〈0.05）；與模型組相比，各給藥組動物肝臟中MTP含量均無顯著性變化（P〉0.05）。對于血清PCSK9含量而言，與模型組 [（1439.47±191.70） pg/mL]相比，除阿托伐他汀組呈顯著性升高外 [（1996.67±96.64）pg/mL]，P〈0.05，其他給藥組同樣無顯著性的變化（P〉0.05）；對于血清Apo-B100，與模型組 [（1560.89±187.73）pg/mL]相比，各給藥組均有所下降，其中阿托伐他汀組 [（1063.39±66.50） pg/mL]以及聯(lián)合給藥組 [（1113.67±54.31） pg/mL]具有顯著性差異 （P〈0.05）；對于血清LDLR，相比于正常組，模型組動物呈顯著性降低（P〈0.001），而經(jīng)過藥物連續(xù)干預(yù)10周后，與模型組相比，血清LDLR水平均有所增加，其中消瘀降脂膠囊組以及聯(lián)合給藥組具有顯著性差異（P〈0.05以及P〈0.001）。

圖3 各組新西蘭大白兔體內(nèi)MTP、PSCK9、LDLR、Apo-B100含量

2.6 脂質(zhì)代謝間接或直接調(diào)控相關(guān)受體活性 如圖4所示，與正常對照組的血清PPAR-γ [（43.28±2.21） ng/mL]以及肝臟相比SREBP-2[（607.86±52.89） pg/g] 模型組動物的血清PPAR-γ [（52.92±2.41） ng/mL] 以及肝臟SREBP-2[（445.18±24.72） pg/g] 分別呈現(xiàn)顯著性升高與降低（P〈0.05）。相比于模型組，各給藥組動物的血清PPAR-γ水平均呈顯著性升高（P〈0.05）； 相比于模型組，各給藥肝臟SREBP-2水平有所增加，其中阿托伐他汀組以及聯(lián)合給藥組均具有顯著性差異（P〈0.05）。

圖4 各組新西蘭大白兔體內(nèi)PPAR-γ以及SREBP2含量

3 討論

血脂水平檢測結(jié)果說明消瘀降脂膠囊與阿托伐他汀均可以顯著性的預(yù)防高血脂形成，且在臨床劑量下，阿托伐他汀與消瘀降脂膠囊藥效相當(dāng)；同時，相比于阿托伐他汀單用，與消瘀降脂膠囊聯(lián)合用藥可進一步強化預(yù)防新西蘭兔的高血脂形成。實驗結(jié)果，提示消瘀降脂膠囊與阿托伐他汀在預(yù)防高血脂的形成上具有一定的協(xié)同作用，且可能存在不同的作用機制；人體內(nèi)的脂質(zhì)來源包括吸收外源性脂質(zhì)以及自身合成。HMGCR、鯊烯合酶、羊毛甾醇合酶等參與了體內(nèi)膽固醇合成，其中HMGCR是合成膽固醇的限速酶[4]。本研究結(jié)果表明，類似于阿托伐他汀，消瘀降脂膠囊類可以直接通過抑制HMGCR的活性，從而抑制內(nèi)源性的膽固醇合成，發(fā)揮高血脂的預(yù)防作用。

LPL為TG水解酶，參與了血液循環(huán)系統(tǒng)以及內(nèi)源性的TG代謝，在富含TG的脂蛋白如極低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein，VLDL） 以及乳糜微粒 （Chylomicron，CM）的分解及HDL的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LPL活性降低或表達缺陷可導(dǎo)致CM及VLDL降解障礙，引起高TG及低HDL水平，最終誘發(fā)形成高脂血癥[5]。本實驗研究表明，不同于阿托伐他汀，消瘀降脂膠囊可以通過提高LPL的活性，降低TC及TG的含量，進而發(fā)揮降脂作用。消瘀降脂膠囊對LPL的活性影響可能與其主要成分之一山楂提取物的藥理作用有關(guān)。張曼等[6]同樣報道了山楂可影響高脂血癥小鼠血脂的形成以及脂蛋白酯酶和肝酯酶活性，結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致。另一方面，本實驗結(jié)果也說明了LPL活性降低可能是高脂血癥的發(fā)病機制之一，增強LPL活性可能是治療高脂血癥的一個有效途徑；本研究結(jié)果提示消瘀降脂膠囊預(yù)防高脂血癥的形成可能與提高LPL酶的活性有關(guān)。

膽固醇不僅可以自身合成，也可以來源于食物。NPC1L1是一種跨膜蛋白，主要表達在肝細胞和空腸上皮細胞上。NPC1L1參與了體內(nèi)膽固醇的吸收、重吸收以及膽酸的分泌。有研究表明，小鼠的NPC1L1基因被敲除后，其血漿中TC含量減少了近86%[7]。不僅如此，NPC1L1還與參與了膽汁酸中TC的重吸收，研究發(fā)現(xiàn)肝細胞中的NPC1L1表達升高時，膽汁中TC含量下降而血漿中TC水平將上升[8]。NPC1L1由于其在膽固醇的吸收和重吸收中的重大藥理作用，已成為降低血漿TC藥物開發(fā)的重要靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，動物經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)后小腸NPC1L1水平顯著性增加，與蒙廣星等[9]的研究結(jié)果基本一致。更值得注意的是，不同于阿托伐他汀，動物經(jīng)消瘀降脂膠囊預(yù)防給藥后，體內(nèi)的NPC1L1的活性顯著性下降，提示消瘀降脂膠囊可能通過抑制NPC1L1的活性，影響膽固醇吸收、膽酸的分泌和重吸收，從而降低血漿膽固醇水平，發(fā)揮高血脂的預(yù)防與治療作用。

參與血漿中轉(zhuǎn)運、脂蛋白分泌、消除等體內(nèi)代謝過程有關(guān)的酶或蛋白主要有MTP、PCSK9、ApoB100等，通過改變它們的活性或功能可調(diào)節(jié)HDL濃度[10]；MTP作為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白與VLDL以及載脂蛋白B（ApoB）的形成與組裝密切有關(guān)，其主要分布在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及小腸細胞上。研究表明，MTP抑制劑可降低LDLR缺陷導(dǎo)致的高脂血癥兔子血漿中VLDL和LDL含量[11]。因此，MTP被認(rèn)為是調(diào)節(jié)血脂的重要靶點。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飼料誘導(dǎo)喂養(yǎng)一段時間后，動物體內(nèi)的MTP水平顯著性升高，與文獻報道基本一致，但無論阿托伐他汀、消瘀降脂膠囊還是藥物聯(lián)用，動物體內(nèi)的MTP水平均沒有顯著性的變化，提示消瘀降脂膠囊的發(fā)揮降脂藥效可能不是直接作用于MTP的表達。

ApoB包括Apo B48以及Apo B100是形成CM、LDL等必須條件，在維持此類脂蛋白的功能中發(fā)揮重要的理化作用。血漿中ApoB的水平與TC的含量呈正向相關(guān)性，ApoB水平的高低可間接地反映出TC的含量。有研究證明，通過抑制ApoB的活性或者表達，可顯著性的降低血漿中TC水平[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)后，動物肝組織中的ApoB100顯著性的提高，而消瘀降脂膠囊藥物干預(yù)后，ApoB100水平則顯著性的下降，提示消瘀降脂膠囊具有調(diào)節(jié)載脂蛋白代謝的作用，這可能與消瘀降脂膠囊中的丹參提取物的藥理活性有關(guān)，本文的研究與閔連秋等的臨床研究結(jié)果也頗為相似[13]。

與apoB-100相似，PSCK9在脂代謝方面同樣也發(fā)揮著重要的生理作用。研究表明，PCSK9基因突變或多態(tài)性可以導(dǎo)致動脈粥樣硬化心血管疾病（arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD） 風(fēng)險升高。人體內(nèi)LDL-c的清除與代謝依賴于LDL顆粒與LDLR的結(jié)合效率。當(dāng)LDL-c被清除后，LDLR從LDL顆粒中被釋放出來，會再次循環(huán)至肝細胞表面重新參與LDL-c的清除。在上述過程中，由肝細胞分泌的PCSK9會進入血液循環(huán)中，從而與LDLR結(jié)合，形成“PCSK9-LDLR”復(fù)合體。該復(fù)合體誘導(dǎo)LDLR進入溶酶體中被降解，使血漿中LDLR的含量或濃度降低，使得LDL-c的清除效率受限，最終導(dǎo)致LDL-c的水平升高。有趣的是，本文的研究結(jié)果提示：相比于模型組，阿托伐他汀組動物體內(nèi)的LDLR和PCSK9的水平被同時上調(diào)，而后者則潛在地限制了阿托伐他汀降低LDL-c濃度的藥理作用，這一現(xiàn)象被稱為他汀藥物的“矛盾效應(yīng)”或“6%效應(yīng)”其原因是由于他汀類藥物抑制細胞內(nèi)HMGCR的活性，抑制細胞內(nèi)膽固醇的合成，當(dāng)細胞內(nèi)膽固醇水平降低至某一水平時，固醇調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白2（SREBP-2） 被激活[14]。本研究提示，相比于模型組，阿托伐他汀給藥10周后，兔子肝臟中SREBP-2的水平顯著性升高，被激活的SREBP-2進一步上調(diào)了LDLR，PCSK9和HMGCR的表達。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，消瘀降脂膠囊不同于阿托伐他汀，盡管藥物干預(yù)給藥10周，組織中HMGCR的水平顯著性降低，但SREBP-2以及PCSK9卻未發(fā)現(xiàn)顯著性升高，說明消瘀降脂膠囊對HMGCR的抑制作用，但尚不足以激活SREBP-2信號通路，不會進一步導(dǎo)致PCKS9上調(diào)，從而避免產(chǎn)生類似他汀藥物的“矛盾效應(yīng)”，這可能是消瘀降脂膠囊與阿托伐他汀在降脂藥理作用上的本質(zhì)區(qū)別之一。

過氧化物酶體增生激活受體（包括PPAR-α、PPAR-γ以及PPAR-β/δ三種亞型） 在脂質(zhì)代謝的整體調(diào)控中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ被激活后，可以促進巨噬細胞的膽固醇外排，抑制泡沫細胞形成；同時，PPARγ還具有抑制炎性因子、促進巨噬細胞凋亡、抑制內(nèi)皮素的釋放等作用，使血管擴張、改善血管張力發(fā)揮其抗AS的作用繼而減輕斑塊的形成，可能對AS的防治具有重要意義[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，消瘀降脂膠囊預(yù)防給藥10周，可以顯著性提高動物體內(nèi)PPARγ的表達，提示其抗AS形成作用，與前期的研究基本一致。

4 結(jié)論

消瘀降脂膠囊與阿托伐他汀均可以顯著性地預(yù)防高血脂形成，且在臨床劑量下，阿托伐他汀與消瘀降脂膠囊的預(yù)防降脂藥效相當(dāng)；相比于阿托伐他汀單用，與消瘀降脂膠囊聯(lián)合用藥可進一步加強預(yù)防新西蘭兔的高血脂形成；消瘀降脂膠囊的降脂作用是多靶點的，包括LDL-R、HMG-CoA還原酶、NPC1L1、PPAR-γ、LPL等，通過對相關(guān)酶或者脂質(zhì)代謝受體的調(diào)控，抑制小腸中的膽固醇吸收以及肝臟細胞內(nèi)膽固醇合成，并加強血液中甘油三酯水解等藥理作用；消瘀降脂膠囊與阿托伐他汀的降脂藥理機制既有相似之處，也有不同之處；其不同在于，消瘀降脂膠囊的細胞內(nèi)膽固醇合成抑制作用不會激活SREBP2信號通路，不會因此產(chǎn)生類似于他汀的降脂“矛盾效應(yīng)”。