李艷艷，李鋒濤，金禮琴，陳 毓，吉鈺萍，吳 悅，楊海峰，喬秋萍，卜仕金，李勇軍*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；3.江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司，江蘇泰州 225300)

蜘蛛香為敗醬科植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根莖和根，又名馬蹄香，收載于2015年版《中國獸藥典》，性味辛、苦、溫，具有理氣止痛、消食止瀉、祛風(fēng)除濕的功效，主治肚腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風(fēng)濕痹痛[1-3]。蜘蛛香主要含有揮發(fā)油、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和多糖等化學(xué)成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蜘蛛香提取物不僅具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、雙向調(diào)節(jié)腸道蠕動等作用[5-7]，對革蘭陽性菌、輪狀病毒及非輪狀病毒引起的腸炎也具有較好的療效[8-9]。蜘蛛香含藥血清能夠增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，提高腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平和吞噬能力，具有一定的免疫增強(qiáng)作用[10]。

細(xì)小病毒性腸炎是一種犬和貓的急性高度接觸性傳染性腸炎，主要臨床癥狀為嘔吐和腹瀉，臨床大多采用“高免血清+單抗+對癥療法+支持療法”的綜合措施，治療成本較高。針對寵物臨床用藥需求，課題組以蜘蛛香藥材為原料研制了國家三類新獸藥蜘蛛香膠囊([2017]新獸藥證字02號)。該制劑具有行氣止痛、健脾止瀉的功效，主治犬細(xì)小病毒性腸炎。橙皮苷(hesperidin)是蜘蛛香的主要化學(xué)成分之一，含量高，穩(wěn)定性好。本試驗對蜘蛛香膠囊中的橙皮苷進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別和高效液相色譜(HPLC)含量測定，為蜘蛛香膠囊的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LC20A型高效液相色譜儀，配備SPD-20A紫外檢測器、LC-20AT雙泵、HT-220A柱溫箱，日本島津公司產(chǎn)品；UV-2250型紫外可見分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；AS1201型自動進(jìn)樣器，大連依利特公司產(chǎn)品；BT25S型電子天平，北京賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.1.2 藥物和試劑 蜘蛛香膠囊，規(guī)格0.25 g/粒，批號分別為150826、150828、150830、150906、150908、150910，江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；橙皮苷對照品，批號110721-201316，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為自制純化水，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 TLC鑒別

1.2.1.1 供試液的制備 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物0.3 g，加甲醇20 mL加熱回流20 min，濾過。取濾液10 mL，濃縮至2 mL，即得。

1.2.1.2 對照藥材溶液的制備 另取蜘蛛香對照藥材0.3 g，按“1.2.1.1”方法制成對照藥材溶液。

1.2.1.3 對照溶液的制備 再取橙皮苷對照品，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作為對照品溶液。

1.2.1.4 薄層鑒別 吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一用5 g/L氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.2 HPLC含量測定

1.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的溶液。

1.2.2.2 供試品溶液制備 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，分別取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.3 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18MG(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；流速：1.0 mL/min，檢測波長：284 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取橙皮苷對照品20 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液0.5、1、2、5、10、20 mL，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成8、16、32、80、160、320 μg/mL系列濃度的對照品溶液。精密吸取上述不同濃度的對照品溶液20 μL，分別進(jìn)樣，測定峰面積。以橙皮苷進(jìn)樣量x(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一濃度的橙皮苷對照品溶液20 μL，按“1.2.2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算RSD。

1.2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取蜘蛛香膠囊內(nèi)容物0.5 g，精密稱定，按“1.2.2.2”項下制備供試品溶液，分別于配制后0、1、3、6、12、24 h，按“1.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，測定峰面積，計算RSD。

1.2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批號的蜘蛛香膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.5 g(精密稱量)，按“1.2.2.2”的方法制備供試品溶液，并按“1.2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算RSD。

1.2.2.8 加樣回收率試驗 取同一批號已知橙皮苷含量的蜘蛛香膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.5 g，精密稱定，每份分別精密加入橙皮苷對照品溶液20 mL(0.2005 mg/mL)，按“1.2.2.2”制備供試品溶液，并按“1.2.2.3”色譜條件進(jìn)樣測定。

1.2.2.9 樣品含量測定 取不同批次的蜘蛛香膠囊內(nèi)容物，每批取3份，每份約0.5 g(精密稱量)，按“1.2.2.2”制備供試品溶液，并按“1.2.2.3”色譜條件進(jìn)樣測定，測得峰面積，用外標(biāo)法計算出橙皮苷含量，并換算成每粒蜘蛛香膠囊中所含的橙皮苷含量。

2 結(jié)果

2.1 TLC鑒別

TLC色譜圖見圖1，可見斑點清晰，顯色效果好，供試品色譜在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，說明TLC能鑒別出橙皮苷。

1.橙皮苷對照品(Hesperidin reference) 2.蜘蛛香對照藥材(Valerianajatamansireference)3.蜘蛛香膠囊供試品(Tested sample ofValerianajatamansicapsule)

圖1橙皮苷的薄層色譜圖

Fig.1 The TLC chromatogram of hesperidin

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 色譜行為 HPLC色譜圖見圖2，在上述色譜條件下，橙皮苷與供試品溶液中的其他組分分離度良好，其保留時間在14.6 min左右，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程y=1 906 206.20x+102 959.48，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，橙皮苷進(jìn)樣量在0.16 μg～6.4 μg范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度 同一濃度(32 μg/mL)的橙皮苷對照品溶液峰面積的RSD為0.43%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性 測得同一批次(批號150826)蜘蛛香膠囊中橙皮苷的平均含量為2.11 mg/粒，RSD為1.9%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性 同一供試品溶液(批號150826)在制備后24 h內(nèi)，不同時間點所測得的橙皮苷峰面積的RSD為1.7%(n=6)，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率 加樣回收率試驗結(jié)果見表1，橙皮苷的平均回收率為97.7%，RSD為1.3%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

1.橙皮苷； A.橙皮苷對照品； B.蜘蛛香膠囊供試品 1.Hesperidin；A.Reference of hesperidin； B.Tested sample of Valeriana jatamansi capsule

圖3 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.6 樣品含量測定 6批次蜘蛛香膠囊橙皮苷含量測定結(jié)果見表2，橙皮苷平均含量為2.08 mg/粒。

3 討論

安全、有效、質(zhì)量可控是對獸藥開發(fā)和生產(chǎn)的基本要求，而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究是獸藥質(zhì)量可控的必需過程。近年來，在中獸藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，采用TLC和HPLC法測定中獸藥的主要成分，已有大量文獻(xiàn)報道，并因其快速、靈敏、高效、準(zhǔn)確等特點而被廣泛應(yīng)用[11]。新獸藥蜘蛛香膠囊為單方硬膠囊劑，蜘蛛香藥材中含有橙皮苷，本研究分別采用TLC和HPLC法對蜘蛛香膠囊中的橙皮苷進(jìn)行了定性和定量分析。

表1 蜘蛛香膠囊中橙皮苷的加樣回收率試驗

本試驗參照2010年版《中國獸藥典》(二部)陳皮中橙皮苷的薄層色譜條件，對蜘蛛香膠囊中的橙皮苷進(jìn)行了定性鑒別，獲得的薄層色譜圖斑點清晰，顯色效果好，表明橙皮苷的TLC法鑒別可以作為制定蜘蛛香膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。參考文獻(xiàn)報道的蜘蛛香藥材中橙皮苷HPLC檢測方法[12-14]，本試驗分別選擇了乙腈1 mL/L磷酸溶液(15∶80)、乙腈∶水(15∶85)、甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)、乙腈20 mL/L醋酸溶液(18∶82)等幾種不同組成及不同比例的流動相進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)作為流動相獲得的色譜峰峰形較好，橙皮苷的分離效果最好。同時還試驗了不同生產(chǎn)廠家的色譜柱，如Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Platisil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK C18MG (S-5)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Grace Alltima C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)等，各個色譜柱的峰形均較好，橙皮苷也能較好分離，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算都高于3 000。表明所建立的HPLC方法系統(tǒng)適應(yīng)性較好，靈敏度高。

6個不同批次的蜘蛛香膠囊中橙皮苷(C28H34O15)的平均含量為2.08 mg/粒，考慮不同產(chǎn)地蜘蛛香藥材中橙皮苷含量的差異，以含量測定值的80%作為含量下限，本品每粒含蜘蛛香以橙皮苷(C28H34O15)計，不得少于1.66 mg。表明采用TLC和HPLC法對蜘蛛香膠囊中的橙皮苷進(jìn)行定性和定量分析，具有準(zhǔn)確、簡便、重復(fù)性好等特點，可用于該中獸藥的質(zhì)量控制。

表2 蜘蛛香膠囊中橙皮苷的含量測定結(jié)果(mg/粒)