王春霞，喻 進(jìn)，盧曉曉，寧官保，張 鼎，馬海利，高文偉，高詩(shī)敏，李建慧，李桂蘭，閆 芳，趙宇軍*，田文霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

脛骨軟骨發(fā)育不良(Tibial dyschondroplasia，TD)是家禽脛跗骨近端生長(zhǎng)板形成不能礦化及血管化的軟骨栓，從而導(dǎo)致站立困難及運(yùn)動(dòng)障礙的群發(fā)性疾病[1-2]。該病導(dǎo)致肉雞抗病性能下降和生產(chǎn)性能降低，從而給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，因此對(duì)其發(fā)病機(jī)理的研究成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。為了探究TD的發(fā)病機(jī)制，田文霞等[3-5]通過使用福美雙誘發(fā)TD，發(fā)病率高，穩(wěn)定性好，病理變化與正常發(fā)病一致，由此成功構(gòu)建肉雞TD模型，為深入研究TD發(fā)病機(jī)理提供可靠、充足的試驗(yàn)基礎(chǔ)。基于福美雙誘發(fā)的TD模型，Tian等[6]應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)結(jié)合cDNA芯片篩選差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，在TD發(fā)生過程中，sFRP4基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，Tian等[7]后續(xù)通過Affymetrix芯片篩選不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，sFRP4基因也表達(dá)上調(diào)，并在誘導(dǎo)TD后第1、2、6天分別上調(diào)高達(dá)2.8、73.5、11.6倍，這正好驗(yàn)證了前期應(yīng)用SSH篩選中的基因差異表達(dá)結(jié)果。

作為sFRP家族蛋白成員之一，分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(secreted frizzled-related protein 4，sFRP4)是Wnt信號(hào)通路的拮抗劑。Wnt信號(hào)通路控制著如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖以及干細(xì)胞和祖細(xì)胞的自我更新等多種過程[8]。除此之外，Wnt信號(hào)通路與軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生有著密切的關(guān)系[9]。Tamamura等[10]研究認(rèn)為Wnt/β-Catenin信號(hào)通路對(duì)生長(zhǎng)板形成、調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞成熟以及軟骨內(nèi)骨化都有著至關(guān)重要的作用。Kerkhofs等[11]和Andrade等[12]同樣證明Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控軟骨內(nèi)骨化。體外研究表明Wnt信號(hào)通路與軟骨細(xì)胞的成熟高度相關(guān)，而且活化的β-Catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子可加快軟骨細(xì)胞分化[13]，并促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化[14]。體內(nèi)研究也表明激活的Wnt信號(hào)通路可促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大及成熟[15]。sFRP家族蛋白通過與Frizzled(Fz)蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt蛋白，發(fā)揮抑制Wnt信號(hào)通路的生物學(xué)作用，同時(shí)間接影響與Wnt通路相交聯(lián)的其他信號(hào)通路。Wang等[16]研究證實(shí)sFRP1能通過Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，可見sFRP家族蛋白對(duì)Wnt信號(hào)通路有一定的影響。因而研究和分析sFRP4基因及其蛋白的特性與信息，對(duì)后續(xù)研究Wnt信號(hào)通路與TD發(fā)病機(jī)理之間的關(guān)系有著重大意義。

本研究通過real-time PCR對(duì)基因芯片篩選的sFRP4基因差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)sFRP4基因及其預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 肉雞(艾維茵)脛骨軟骨生長(zhǎng)板組織(福美雙誘導(dǎo)TD后第1、2、6天)，樣品獲得見文獻(xiàn)[17]，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物醫(yī)學(xué)示范中心生物制品實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 Trizol Reagent，Invitrogen公司產(chǎn)品；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，Toyobo公司產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶、dNTP、DNase-I，武漢晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 所用引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Gallus的sFRP4基因的序列作模板，用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。序列為上游引物5′GCTGAATCTATCTGCTGTTGGG3′，下游引物5′CTAACACTGTAAGCATATTCCTGGC3′，擴(kuò)增片段136bp；內(nèi)參基因RPS16引物序列的上游引物5′ACAAACTGCTTGAACCTGTCCTC3′，下游引物5′GCTTTGGAAATAGCTTGACGG3′，擴(kuò)增片段127bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2 生長(zhǎng)板總RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè) 取本實(shí)驗(yàn)室保存的生長(zhǎng)板樣品，按照Trizol試劑盒操作步驟提取總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA質(zhì)量和濃度，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Real-time PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因 用上述合成的引物進(jìn)行real-time PCR的擴(kuò)增體系(總體積25 μL)：cDNA 1 μL，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μmol/L，滅菌水補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 Real-time PCR數(shù)據(jù)分析 以各對(duì)照組為參照，使用2-△△Ct法計(jì)算sFRP4在各組中的相對(duì)表達(dá)量，取攻毒組與對(duì)照組的差異倍數(shù)均值。

1.2.5 雞生長(zhǎng)板sFRP4基因的生物信息學(xué)分析 通過NCBI中Gene數(shù)據(jù)庫(kù)獲得sFRP4基因定位及組成等信息，同時(shí)采用在線ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析該基因。經(jīng)ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性質(zhì)，經(jīng)ProScale程序(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白疏水性，經(jīng)DictyOGlyc 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)進(jìn)行蛋白糖基化位點(diǎn)分析，經(jīng)NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，經(jīng)Signal-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，經(jīng)TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白的跨膜區(qū)，經(jīng)PROSITE程序(http://prosite.expasy.org/)分析蛋白結(jié)構(gòu)域，同時(shí)應(yīng)用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)與SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr)對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。運(yùn)行SWISS-model(http://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，最后通過STRING(http://string-db.org/)，限定相關(guān)蛋白數(shù)，自動(dòng)構(gòu)建與sFRP4蛋白相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR驗(yàn)證sFRP4的差異表達(dá)

用real-time PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果中的表達(dá)差異基因sFRP4進(jìn)行檢測(cè)，real-time PCR獲得的基因差異表達(dá)結(jié)果與基因芯片中結(jié)果基本一致，在第1、2、6天均為上調(diào)表達(dá)，將兩者表達(dá)信息對(duì)比(圖1)。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR與微陣列結(jié)果的比較

2.2 雞sFRP4基因結(jié)構(gòu)信息

sFRP4基因位于2號(hào)染色體46 736 104～46 746 404之間，基因全長(zhǎng)10 300 bp，外顯子有6個(gè)，mRNA全長(zhǎng)2 847 bp，通過ORF Finder分析得到一個(gè)993 bp的開放閱讀框，推測(cè)編碼331個(gè)氨基酸。

2.3 雞sFRP4蛋白基本理化性質(zhì)

理論分子質(zhì)量為37 704.7 u，理論等電點(diǎn)為9.50，負(fù)電荷氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)30個(gè)，正電荷氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)53個(gè)，原子組成為C1638H2663N489O477S27，原子總數(shù)為5 294。N端第1個(gè)氨基酸是蛋氨酸，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為63.13(大于40認(rèn)為該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定)，脂肪系數(shù)為73.63，平均親水性為-0.582。含強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)31個(gè)，占總氨基酸9.3%，強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)54個(gè)，占16.2%，極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)103個(gè)，占30.9%，疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)71個(gè)，占21.3%(圖2)。

圖2 各氨基酸組成百分比

2.4 雞sFRP4蛋白疏水性分析

經(jīng)分析，sFRP4的最大疏水指數(shù)為2.5，最小疏水指數(shù)為-2.95。根據(jù)指數(shù)越小，親水性越強(qiáng)的規(guī)律來看，從圖中可以看出親水性氨基酸均勻分布于整條多肽鏈，且多于疏水性氨基酸，推測(cè)該蛋白為可溶性蛋白(圖3)。

圖3 sFRP4蛋白質(zhì)疏水性分析

2.5 雞sFRP4蛋白糖基化位點(diǎn)分析

糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式之一，經(jīng)過分析預(yù)測(cè)，O-糖基化位點(diǎn)只有1個(gè)(圖4)。

2.6 雞sFRP4蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)與酪氨酸(Tyr)3種主要磷酸化部位。經(jīng)分析，該蛋白磷酸化位點(diǎn)共13個(gè)，其中Ser11，Thr1，Tyr1(圖5)。

2.7 信號(hào)肽分析

信號(hào)肽一般位于分泌蛋白的N端，當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生跨膜轉(zhuǎn)移后被切掉。運(yùn)行Signal P 4.1分析預(yù)測(cè)，會(huì)出現(xiàn)4個(gè)分值：Y-score maximum指預(yù)測(cè)的真實(shí)的信號(hào)肽切割位點(diǎn)得分；C-score maximum指可能的信號(hào)肽切割位點(diǎn)得分；S-score maximum指信號(hào)肽組成的可能的大小得分；S-score mean指S-score的平均得分。一般認(rèn)為S-score mean>0.5，則預(yù)測(cè)為分泌性蛋白，存在信號(hào)肽。經(jīng)過分析，C值0.728，Y值0.729，S值0.864，S平均值0.729，大于0.5，剪切位點(diǎn)位于20與21殘基之間，推測(cè)sFRP4蛋白有信號(hào)肽(圖6)。

圖4 sFRP4蛋白的糖基化位點(diǎn)分析

圖5 sFRP4蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

圖6 sFRP4蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)

2.8 跨膜區(qū)分析

TMHMM Server 2.0程序采用隱馬氏模型，分析綜合了電荷偏離、膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)限制和螺旋長(zhǎng)度、跨膜區(qū)疏水性等特征，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)膜內(nèi)外及跨膜區(qū)進(jìn)行整體預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)顯示sFRP4蛋白無跨膜區(qū)，整個(gè)蛋白都位于膜外(圖7)。

2.9 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

經(jīng)SPOMAN分析顯示，α螺旋占27.19%，延伸鏈占13.60%，無規(guī)則卷曲占58.01%，β轉(zhuǎn)角占1.21%。推測(cè)α螺旋與無規(guī)則卷曲是sFRP4蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件，延伸鏈與β轉(zhuǎn)角則散在于整個(gè)蛋白(圖8)。

圖7 sFRP4蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)

h.α螺旋；c.無規(guī)則卷曲；t.β轉(zhuǎn)角；e.β折疊延伸鏈h.Alpha helix; c.Random coil; t.Beta turn; e.Beta sheet extended strand

2.10 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)行SWISS-model程序，以sFRP3蛋白為模板同源建模，可見α螺旋與無規(guī)則卷曲為sFRP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要原件(圖9)。

圖9 sFRP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

2.11 sFRP4蛋白結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)ScanPtosite程序分析，蛋白質(zhì)有FZ和NTR兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(訪問號(hào)分別為PS50038，PS50189)(圖10)。

圖10 sFRP4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

Fz結(jié)構(gòu)域由120個(gè)氨基酸組成，由于包含了10個(gè)非常保守的半胱氨酸，也叫做CRD(cysteines-rich domine)。Fz結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示主要為α螺旋，此外還有β折疊，保守的半胱氨酸形成二硫鍵。Fz結(jié)構(gòu)域是與Wnt相互作用的部位，對(duì)于Wnt配體的結(jié)合是必要的。NTR結(jié)構(gòu)域由130個(gè)氨基酸組成，共包含6個(gè)保守的半胱氨酸，可能在內(nèi)部形成二硫鍵。通過該程序?qū)FRP家族蛋白(sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP5)進(jìn)行分析，顯示均含有Fz與NTR結(jié)構(gòu)域。

2.12 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)STRING分析，默認(rèn)搜索與sFRP4蛋白相關(guān)的蛋白限制在10個(gè)之內(nèi)，構(gòu)建蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。分析顯示sFRP4蛋白與Fz蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt蛋白，結(jié)果見圖11。

圖11 sFRP4蛋白與其相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

Wnt信號(hào)通路在各組織的發(fā)育與內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，已經(jīng)證實(shí)軟骨形成和軟骨內(nèi)骨化與此通路有很大關(guān)系[18]。本課題組應(yīng)用基因芯片篩選TD發(fā)育不同時(shí)期差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，sFRP4基因差異表達(dá)顯著，而sFRP4是Wnt信號(hào)通路的拮抗劑，這表明sFRP4可能通過Wnt信號(hào)通路從而影響TD的發(fā)生與發(fā)展。但是，sFRP4通過Wnt信號(hào)通路是否是主要影響TD的原因，或者是通過與之交聯(lián)的其他信號(hào)通路發(fā)揮作用，這些都還不得而知，并且國(guó)內(nèi)外關(guān)于sFRP4的研究鮮見于報(bào)告，因而在深入分子水平具體研究之前，sFRP4基因及其蛋白的生物信息學(xué)分析是很有必要的。

本研究應(yīng)用real-time-PCR技術(shù)對(duì)基因芯片篩選的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明兩者變化趨勢(shì)一致，結(jié)論相互印證，說明了基因芯片的可靠性，同時(shí)也表明了sFRP4基因差異表達(dá)的保真性，為后續(xù)研究提供了可靠的數(shù)據(jù)和理論支撐。sFRP4基因的生物信息學(xué)分析顯示，其編碼331個(gè)氨基酸，蛋白平均親水性-0.582，整條多肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表現(xiàn)為親水性，推測(cè)為可溶性蛋白質(zhì)；通過二級(jí)結(jié)構(gòu)、同源建模分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋與無規(guī)則卷曲為主。這些都為后續(xù)研究如蛋白表達(dá)、提純，以及功能的研究提供有價(jià)值的參考。

糖基化是蛋白翻譯后的修飾方式之一，總共有四類，其中O-糖基化在高爾基體中進(jìn)行，以絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸的羥基為連接點(diǎn)。糖基化的結(jié)果使不同的蛋白質(zhì)帶上不同的標(biāo)記，改變多肽的構(gòu)象與增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。分析預(yù)測(cè)整條多肽鏈中只有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，sFRP4蛋白不穩(wěn)定，可能極少的糖基化位點(diǎn)是該蛋白不穩(wěn)定的原因之一；同時(shí)磷酸化也是蛋白質(zhì)翻譯后的修飾方式，整條多肽鏈共有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中大部分位于sFRP4蛋白的兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(CRD、NTR)內(nèi)。研究表明，CRD是Fz蛋白的保守結(jié)構(gòu)域， Wnt蛋白通過CRD結(jié)構(gòu)域與Fz蛋白結(jié)合，從而啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路[19]。sFRP4蛋白具有信號(hào)肽，無跨膜區(qū)，提示其可能在胞內(nèi)進(jìn)行磷酸化等翻譯后修飾，隨后分泌出胞外，發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt蛋白的作用，而存在磷酸化位點(diǎn)的CRD保守結(jié)構(gòu)域則是其發(fā)揮功能的重要原因。

不同的研究表明，Wnt信號(hào)通路對(duì)于軟骨細(xì)胞成熟、肥大，以及骨的形成是不可或缺的[20]。Enomoto等[21]研究表明在雞發(fā)育過程中，Wnt8A過表達(dá)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟、肥大、鈣化，同樣Wnt9A過表達(dá)也會(huì)加快軟骨細(xì)胞的肥大[22]。通過STRING分析蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，sFRP4蛋白與Fz蛋白可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt3A、Wnt8A、Wnt9A、Wnt10A等蛋白，提示其可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt8A等蛋白，從而抑制Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而影響正常軟骨內(nèi)骨化。

本研究驗(yàn)證了前期用芯片技術(shù)篩選的差異表達(dá)基因sFRP4的準(zhǔn)確性與可靠性，并對(duì)sFRP4基因及其預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為今后研究sFRP4蛋白生物學(xué)功能及其參與Wnt信號(hào)通路對(duì)TD的影響奠定一定的理論基礎(chǔ)。