萬 潤，華 敏，龍立書，賀欣薇，張明洋，周碧君,2，王開功,2，程振濤,2，文 明,2*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究室，貴州貴陽 550025)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起家禽和野生鳥類等發(fā)生感染死亡的一種急性高度接觸性傳染病[1]。由于AI對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的傳染病。AIV屬于A型流感病毒，依據(jù)其外膜血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，可分為18個H亞型(H1～H18)和11個N亞型(N1～N11)，其組合可以產(chǎn)生眾多亞型[2-3]。除H17N10和H18N11亞型分離自蝙蝠，目前已知的各亞型流感病毒均可在禽類中分離得到[4]。

目前，我國N6亞型AIV具有較高的分離率。2007年-2015年，我國江蘇、云南、上海等地在飼養(yǎng)雞中檢測到H4N6亞型AIV[5-7]；2009年-2014年，廣西、湖南、貴州等地在飼養(yǎng)鴨中檢測到H6N6亞型AIV[8-10]。2014年5月，四川省南充市發(fā)現(xiàn)全球第1例人感染H5N6亞型AIV并致死病例，隨后在浙江、廣東也出現(xiàn)了人感染H5N6 AIV病例，H5N6亞型AIV開始成為人感染病例的主流[11-12]。畢玉海等[13]研究發(fā)現(xiàn)H5N6亞型AIV毒株中的NA基因多來源于H6N6亞型AIV。因此，開展N6亞型AIV流行毒株N6基因遺傳變異分析對H5N6亞型AIV感染的防控具有重要意義。本試驗對H6N6亞型AIV貴州株N6基因進(jìn)行克隆和序列分析，以期為禽流感分子流行病學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H6N6亞型AIV貴州株4株分別為A/duck/Guizhou/01/2017(H6N6)(GenBank №MG43499)、A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6)(GenBank №MG434500)、A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)(GenBank №MG434501)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)(GenBank №MG434502)；陽性對照H6N6亞型AIV毒株A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6)(GenBank №KU76236)，均為貴州大學(xué)動物疫病研究所分離鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑 PM19-T Vector、限制性內(nèi)切酶EcorⅠ和HindⅢ、瓊脂糖、2xTaqPCR Mix、DNA Marker DL 2 000、Marker DL 5 000、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒等，為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒等，為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照GenBank上AIV N6基因序列(登錄號為KJ484613)，設(shè)計N6基因特異性引物(N6-F：5′-GCCGGAATTCATGAATCCAAATCAAAAGATAAC-3′(EcoRⅠ)和N6-R：5′-GGCCGAAGCTTCTACTTAAAGTAGATGATTTCA- GC-3′(HindⅢ)，引物預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 413 bp，由上海英淮捷基有限公司合成。

1.2.2 目的基因PCR擴(kuò)增 采用鴨胚增殖病毒后，收集鴨胚尿囊液，RNA提取試劑盒提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，N基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 μL：ddH2O 19 μL、2×TaqPCR Mastermix 25 μL、N6-F/N6-R各2 μL和模板DNA 2 mL；反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 40 s、56℃ 50 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；最后72℃ 10 min。同時以A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6)毒株和ddH2O作為陽性及陰性對照。取9 μL樣品PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。

1.2.3 目的基因克隆測序 采用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，加Solution Ⅰ連接酶，與pMD19-T載體連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落藍(lán)白斑篩選；挑取白色菌落接種在含Amp+的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定；取陽性重組質(zhì)粒送至上海Invitrogen公司測序。

1.2.4 目的基因序列分析 取測序得到的目的基因序列，與GenBank中AIV代表株NA基因序列(表1)進(jìn)行BLAST分析和系統(tǒng)發(fā)生樹繪制，分析目的基因遺傳進(jìn)化情況。

表1 GenBank中NA基因參考株序列信息

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用AIV N6基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)4株毒株樣本均可得到一條約為1 380 bp的目的條段(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相一致，說明本試驗成功擴(kuò)增出H6N6亞型AIV貴州株N6基因。

2.2 目的基因克隆和測序

取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)有約為2 700 bp的載體條段和約為1 380 bp的目的條段，與預(yù)期酶切片段大小相一致，說明本試驗成功構(gòu)建了H6N6亞型AIV貴州株N6基因重組質(zhì)粒。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.NA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；+.陽性；-.陰性

M.DNA Marker DL 2 000；1-4.NA gene PCR amplification products；+.Positive；-.Negative control

圖1 NA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 PCR products of NA genes

2.3 AIV貴州株N6基因同源性分析

經(jīng)同源性分析顯示，4株H6N6亞型AIV貴州株N6基因間的同源性為96.0%～99.1%，與2007年H6N6亞型AIV貴州株同源性僅為87.0%，與2014年H6N6AIV貴州株同源性為93.0%。4株AIV貴州株N6基因與江西H10N6毒株和越南H5N6毒株的同源性在97%以上，其中A/duck/Guizhou/01/2017(H6N6)與江西H10N6毒株同源性最高(97.7%)，與越南H5N6毒株同源性為97.5%；A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6)與越南H5N6毒株同源性為98.5%，與江西H10N6毒株同源性為98.2%；而A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)與日本H5N6毒株同源性達(dá)99.0%，與越南H5N6毒株和江西H10N6毒株同源性為達(dá)97.0%。除上述N6基因外，4株H6N6亞型AIV貴州株N6基因與其他亞型毒株N6基因同源性在88%左右，與其他AIV毒株非N6基因的同源性均低于60%。

2.4 AIV貴州株N6基因遺傳進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，4株H6N6亞型AIV貴州株N6基因在遺傳進(jìn)化樹上處于同一大分支(圖2)，表明4株H6N6亞型AIV貴州株同源關(guān)系比較接近，其中A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)與日本H5N6毒株和韓國H5N6毒株處于同一分支上；而A/duck/Guizhou/01/2017(H6N6)和A/duck/ Guizhou/02/2017(H6N6)與越南N5N6毒株、云南H5N6毒株、江西H10N6毒株和湖南H3N6毒株處于一分支上。從進(jìn)化樹整體看，所有N6亞型毒株與其他非N6亞型毒株明顯位于2個分支上。

2.5 AIV貴州株N6基因編碼蛋白變異分析結(jié)果

經(jīng)對N6基因編碼蛋白氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，4株H6N6亞型AIV貴州株N6基因均可編碼459個氨基酸，其中398處位點氨基酸序列與日本H5N6毒株、越南H5N6毒株、韓國H5N6毒株、江西H10N6毒株、湖南H3N6毒株和云南H5N6毒株的N6基因編碼區(qū)相應(yīng)序列一致。選取同源性較高的N6毒株與4株H6N6亞型AIV貴州株進(jìn)行蛋白變異分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)4株H6N6亞型AIV貴州株N6基因編碼蛋白在第53-63位出現(xiàn)11個氨基酸缺失，感染人毒株的N6基因編碼蛋白除在上述位置缺失11個aa外，在第2-23位aa還缺失22個氨基酸。

3 討論

禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)在病毒感染過程中發(fā)揮雙重功能，一方面對A、B型流感病毒的復(fù)制起重要作用；另一方面它可酶切去掉易感細(xì)胞表面的唾液酸受體，使細(xì)胞免受禽流感病毒的感染，也正是這一功能讓NA成為抗禽流感研究中的活躍領(lǐng)域[14]。在已知流感病毒亞型中，NA有著相似的空間結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域，但其莖部區(qū)長度變化較大。這種改變是由于發(fā)生插入或缺失造成，通常是3個或者3倍數(shù)個核苷酸的插入或缺失，而這些缺失可能改變AIV的宿主特異性及毒力[15-16]。本試驗于2017年收集的4株H6N6亞型AIV貴州株，其NA基因莖部區(qū)缺失33個(175-207)核苷酸，這一結(jié)果與萬春和等[15]研究的H6N6基因(GenBank:GU595163)分析結(jié)果一致，而這一缺失是否導(dǎo)致其宿主特異性及毒力發(fā)生改變，有待進(jìn)一步考究。進(jìn)行編碼蛋白變異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對AIV貴州株N6基因與同源性較高的幾株毒株N6基因均在編碼蛋白第53-63 aa出現(xiàn)11個氨基酸缺失，但A/duck/Guizhou/1128/2007(H6N6)、A/duck/Guizhou/013/2014(H6N6)這兩株病毒并未發(fā)生缺失，2014年H6N6 AIV貴州株的N6基因編碼蛋白第55位由S變?yōu)榱薖，從2014年1個氨基酸的變異到11個氨基酸的缺失，可見NAJ基因的進(jìn)化相對還是比較快，這可能與AIV的不斷變異和重組有關(guān)，也可能與宿主對外界變化的適應(yīng)性相關(guān)。4株H6N6亞型AIV貴州株N6基因與H3N6毒株、H5N6毒株和H10N6毒株N6基因處于同一分支上，這些貴州株N6基因是該毒株NA基因發(fā)生點突變所致還是與其他毒株N6基因發(fā)生重組而來，也有待進(jìn)一步研究。

圖2 NA基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 NA基因氨基酸序列變異位點分析

近年來，N6亞型禽流感病毒毒株在我國呈流行規(guī)模逐漸擴(kuò)大化且宿主范圍多樣性。但到目前為止，N6亞型AIV并沒有引起人們的關(guān)注。自2007年以來，以H6N6亞型AIV的分離率較高，最早分離于鴨，后陸續(xù)在雞、鵝體內(nèi)檢出[17-18]。2012年我國華南地區(qū)首次從豬分離到H6N6亞型AIV[19-20]，提示N6亞型毒株可能具有突破種間屏障獲得感染哺乳動物的能力。2014年四川省南充市首次發(fā)現(xiàn)一例人感染H5N6亞型AIV并致死病例，其NA基因來源于H6N6亞型AIV。同年12月，廣東也發(fā)現(xiàn)一例人感染H5N6亞型AIV病例，其NA基因同樣來源于H6N6亞型AIV[13]。本試驗發(fā)現(xiàn)貴州株A/duck/Guizhou/03/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/04/2017(H6N6)的N6基因與韓國及日本H5N6毒株處于同一分支上，提示N6亞型AIV可能與H5亞型AIV發(fā)生自然重組，并可能在不斷進(jìn)化過程中突破種間屏障而獲得感染人的能力。貴州株A/duck/ Guizhou/01/2017(H6N6)和A/duck/Guizhou/02/2017(H6N6)與江西H10N6及湖南H3N6毒株處于同一分支上，提示N6亞型AIV業(yè)可能與H10及H3亞型AIV發(fā)生自然重組。因此，有必要加強(qiáng)N6亞型AIV監(jiān)測，關(guān)注N6亞型AIV變異趨勢，才能做好禽流感防控工作。