溫貴蘭，陳紹品，張升波，林漢卿，趙德剛

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州貴陽 550006)

貴州從江香豬主產(chǎn)于貴州省黔東南苗族侗族自治州從江縣，具有小、香、純、凈的特點(diǎn)。其優(yōu)良的品質(zhì)，具有較高的科研與經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。干擾素(interferon,IFN)是1957年英國科學(xué)家Isaacs A等用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時首先發(fā)現(xiàn)的一類能干擾和抑制病毒復(fù)制的可溶性細(xì)胞分泌物[4]。按結(jié)構(gòu)和來源的不同，干擾素分為Ⅰ型(IFN-α和IFN-β)、Ⅱ型(IFN-γ)和Ⅲ型(IFN-λ)，3種類型的干擾素具有相似的功能，即抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]。豬干擾素(porcine interferon PoIFN)分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型干擾素包括α、β、ω、δ等多個亞型[6-7]。豬α干擾素由豬白細(xì)胞產(chǎn)生，約17個基因拷貝分布于I號染色體上，翻譯出至少20多個IFN-α亞型[8]。豬干擾素IFN-α作為一種高效的抗病毒細(xì)胞因子，對豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、傳染性胃腸炎病毒等多種病毒具有抑制作用[9-14]。Sang Y等在Marc-145與PAM細(xì)胞上分析了14種干擾素α亞型(α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、α12、α13、α14)、11種IFN-δ亞型，7種IFN-ω亞型，1種IFN-αω以及IFN-β、IFN-ε、IFN-κ亞型對PRRSV的保護(hù)效果，研究結(jié)果表明IFN-α2在Marc-145與PAM細(xì)胞上均表現(xiàn)出最理想的抗病毒活性[15]。

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展，疾病的威脅也隨之增加，尤其是豬病毒性疾病嚴(yán)重制約著行業(yè)的持續(xù)發(fā)展，干擾素制劑作為一種新型生物制劑，在疾病預(yù)防和控制方面發(fā)揮著重要的作用。本文選取我國珍稀物種從江香豬作為研究對象，提取從江香豬肝臟組織RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，特異性引物擴(kuò)增從江香豬的IFN-α2(CJ-poIFN-α2)編碼區(qū)，對CJ-poIFN-α2序列進(jìn)行分子生物信息學(xué)分析，為后期進(jìn)一步研究干擾素的生物學(xué)活性，加快從江香豬的資源開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州從江香豬源肝臟組織由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院張勇副教授惠贈；pUCm-T載體、DH5α菌株購自碧云天生物技術(shù)研究所；反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA抑制劑等試劑購自Promega公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、SanPrep柱式PCR純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DEPC購自AMRESCO公司；Solution I、DL 5 000 Marker購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]與NCBI網(wǎng)站提供的豬源IFN-α2序列，用DNA Star軟件設(shè)計合成相應(yīng)引物。引物序列為poIFN-α2-F：5′-ATGGCCCCAACCTCAGCCTTCC-3′；poIFN-α2-R：5′-TCACAGGTTTCTGGAGGAAGAG-3′，預(yù)擴(kuò)增片段大小為546 bp，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 按生工生物工程(上海)股份有限公司試劑盒說明書操作步驟，提取從江香豬肝臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為：RNA 8 μL，Oligo(dT) 2 μL，總體系10 μL，70℃的水浴作用5 min，取出置于0℃的冰上；再加入如下體系：5×buffer 6 μL，RNasin 1 μL，dNTP 2 μL，MLV 1 μL，H2O 10 μL，將上述總體系30 μL的溶液置于42℃的水浴鍋，反轉(zhuǎn)錄作用1 h，75℃滅活15 min即逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 從江香豬源IFN-α2基因PCR擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，用IFN-α基因引物poIFN-α2-F、poIFN-α2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：poIFN-α2-F、poIFN-α2-R引物各0.5 μL，dNTP(25 mm each)2.5 μL，2×G+C buffer 10 μL，Primestar酶0.5 μL，cDNA 2 μl，H2O 4 μL。擴(kuò)增參數(shù)：94℃ 3 min；94℃ 5 s，58℃ 10 s，72℃ 50 s，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 重組質(zhì)粒pUCm-CJpoIFN-α2的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物采用生工生物工程(上海)股份有限公司SanPrep柱式PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體進(jìn)行連接。連接體系為：PCR產(chǎn)物4.5 μL，Solution I 5 μL，pUCm-T載體0.5 μL，16℃連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂板于含氨芐抗性的平板上培養(yǎng)14 h～16 h，挑選單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR篩選，陽性菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pUCm-CJpoIFN-α2。

1.2.5 從江香豬源IFN-α2序列分析 用在線服務(wù)器(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)對從CJ-poIFN-α2基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析；采用SOPMA在線服務(wù)器(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；采用DNAStar程序中的Protean軟件分析預(yù)測CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白B細(xì)胞表位各參數(shù)；采用SignalP-4.1在線服務(wù)器對CJ-poIFN-α2基因編碼氨基酸序列蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測和分析；下載GenBank不同源的IFN-α2核苷酸序列，以及野豬的IFN-β和IFN-γ核苷酸序列，詳細(xì)信息見表1，采用DNAStar程序中的MegAlign軟件分析CJ-poIFN-α2核苷酸序列的同源性，并用MEGA5.0中的N-J方法構(gòu)建CJ-poIFN-α2核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 參考序列相關(guān)信息

2 結(jié)果

2.1 CJ-poIFN-α2 PCR結(jié)果

提取從江香豬肝臟組織總RNA，經(jīng)RT-PCR獲得從江香豬源IFN-α2，PCR產(chǎn)物條帶見圖1，測序結(jié)果顯示CJ-poIFN-α2編碼區(qū)長為546 bp。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.IFN-α2的PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR products of IFN-α2

2.2 CJ-poIFN-α2序列分析結(jié)果

2.2.1 CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 從江香豬IFN-α2基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，CJ-poIFN-α2基因編碼區(qū)全長為546 bp，編碼181個氨基酸，20種氨基酸中含量較高的氨基酸有亮氨酸(15.5%)、丙氨酸(11.6%)、絲氨酸(8.3%)、谷氨酰胺(7.7%)，而含量較低的氨基酸有色氨酸(1.1%)，酪氨酸(1.7%)、賴氨酸(1.7%)和天冬酰胺(1.7%)；編碼蛋白分子量約為20.31 ku，等電點(diǎn)為5.84(圖2)。

2.2.2 CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析 用SOPMA在線服務(wù)器預(yù)測CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果表明從江香豬IFN-α2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主(圖3和表2)。

圖2 CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

h.α-螺旋；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲；e.β-折疊h.Alpha helix；t.Beta turn；c.Random coli；e.Extended strand

二級結(jié)構(gòu)名Name of secondary structureα-螺旋/% Alpha helixβ-轉(zhuǎn)角/% Beta turnβ-折疊/%Extended strand無規(guī)則卷曲/%Random coliIFN-α2 60.22(109/181)7.18(13/181)4.97(9/181)27.62(50/181)

2.2.3 CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白B細(xì)胞多參數(shù)分析 采用DNAStar程序中的Protean軟件分析預(yù)測CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白B細(xì)胞表位各參數(shù)，Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Jameson-Wolf法和Emini法分別分析該蛋白親水性、柔韌性、抗原指數(shù)和氨基酸表面可及性。綜合分析結(jié)果表明，從江香豬IFN-α2基因編碼蛋白B細(xì)胞表位主要位于46-48、56-58、70-73、155-159、175-178aa，詳見圖4和表3。

2.2.4 CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白信號肽預(yù)測 采用SignalP-4.1在線服務(wù)器對CJ-poIFN-α2基因編碼氨基酸序列蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果顯示，CJ-poIFN-α2基因編碼氨基酸序列蛋白具有信號肽，綜合考慮S值、C值和Y值的得分，第23 aa-24 aa位點(diǎn)預(yù)測為信號肽酶切位點(diǎn)(圖5)。

圖4 CJ-poIFN-α2氨基酸序列的B細(xì)胞多參數(shù)分析

預(yù)測參數(shù)Prediction parameters預(yù)測結(jié)果(aa)Prediction results(aa)親水性 Hydrophlicity53-61,157-159柔韌性 Flexibility26-30,46-49,56-58,61-73,85-87,92-96,101-103,111-118,131-138,155-160,175-178抗原指數(shù) Antigenicity46-48,52-59,65-70,93-96,155-160,175-180表面可及性 Surface Probability plots27-29,43-47,55-58,70-74,115-117,134-136,143-147,153-159,175-181合計 Total46-48,56-58,70-73,155-159,175-178

圖5 CJ-poIFN-α2基因編碼蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

2.2.5 CJ-poIFN-α2核苷酸同源性分析結(jié)果 將CJ-poIFN-α2基因與人源、馬源、綿羊源、雞源、犬源、豬源和牛源等IFN-α2核苷酸序列進(jìn)行同源性比對分析。結(jié)果表明CJ-poIFN-α2核苷酸與豬源IFN-α2(GenBank登錄號：DQ249002；NM-001130219)同源性最高，為98.7%，而與雞源IFN-α2(GenBank登錄號：XM-015277439)核苷酸序列同源性最低，為32.6%；與豬源IFN-β(GenBank登錄號：JF906509)、IFN-γ(GenBank登錄號：GU433229)同源性為38.5%和20.8%，結(jié)果見圖6。進(jìn)一步比對發(fā)現(xiàn)CJ-poIFN-α2與豬源IFN-α2核苷酸序列存在7處堿基的差異，分別是C354T、G392C、T428C、G468A、C477T、G499A、G520T；氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在4處氨基酸的差異，分別是G131A、V143A、V167I、A174S(圖7和圖8)。

2.2.5 CJ-poIFN-α2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 采用MEGA5.0中的N-J方法構(gòu)建CJ-poIFN-α2基因與不同源的IFN-α2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，雞源IFN-α2基因與其他物種的IFN-α2基因構(gòu)成2個分支，顯示雞源的IFN-α2基因與其他物種的IFN-α2基因遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；CJ-poIFN-α2基因與野豬源的IFN-α2基因在同一分支，兩者遺傳關(guān)系最近(圖9)。

圖6 CJ-poIFN-α2核苷酸同源性分析結(jié)果

圖7 CJ-poIFN-α2核苷酸比對差異

圖8 CJ-poIFN-α2氨基酸比對差異

3 討論

IFN-α是機(jī)體內(nèi)白細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)刺激后分泌產(chǎn)生的一種糖蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫等多種生物學(xué)活性，近年來開發(fā)的長效干擾素聚乙二醇(PEG)-IFNα和重組人血白蛋白(rHSA)-IFNα在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[17]。人的IFN-α基因編碼的前體蛋白經(jīng)翻譯后加工成為一條為166個氨基酸的單體肽鏈，沒有糖基化，肽鏈前23個氨基酸為信號肽，在蛋白分泌出細(xì)胞膜時被切除，我們擴(kuò)增的從江香豬IFN-α2編碼區(qū)長為546bp，預(yù)測結(jié)果顯示豬的IFN-α2編碼的肽鏈前23個氨基酸同樣是信號肽序列。有研究報道，干擾素存在種屬特異性，而且親源關(guān)系越近同源性越高，如人的IFN-α與猴的同源性為87.86%，而與犬和鼠的同源性則不到70%[18]。將克隆得到的從江香豬源IFN-α2核苷酸序列與人源、馬源、綿羊源、雞源、犬源、豬源和牛源等IFN-α2核苷酸序列進(jìn)行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)從江香豬源IFN-α2核苷酸序列與豬源IFN-α2同源性最高，為98.7%，而與雞源IFN-α2核苷酸序列同源性最低，為32.6%；進(jìn)一步與豬源IFN-α2核苷酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，從江香豬源IFN-α2核苷酸序列存在7處堿基的變異，與推導(dǎo)的豬源氨基酸序列存在4處氨基酸的差異，說明從江香豬源IFN-α2保守性相對較高，但這些堿基的差異是否與豬的品種、抗病活性存在一定的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

圖9 CJ-poIFN-α2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

貴州從江香豬是我國稀有的微型地方優(yōu)良品種，主產(chǎn)于貴州省從江縣。貴州從江香豬作為地方優(yōu)異的脂肪型小型豬種，具有體型矮小、基因純合、適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是開展相關(guān)疾病研究的理想實(shí)驗(yàn)動物模型，具有廣闊的開發(fā)利用前景[19]。本研究通過RT-PCR、克隆測序等方法獲得從江香豬源IFN-α2基因編碼區(qū)，并采用生物學(xué)軟件對該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果為后期進(jìn)一步研究干擾素的生物學(xué)活性，加快從江香豬的資源開發(fā)與利用，以及進(jìn)一步發(fā)掘香豬機(jī)體免疫因子奠定基礎(chǔ)。