孫 舉，高倩文，曲雪婷，仝 舟，畢玉海，尹燕博*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100000)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種腸道傳染病，該病通常多發(fā)于寒冷的冬春季節(jié)，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、消瘦、脫水，最終導(dǎo)致死亡[1-3]。盡管疫苗的應(yīng)用對(duì)該病的控制起到了一定的作用，但該疫病在部分地區(qū)仍有不同程度的發(fā)生和流行[4-6]。

通過(guò)噬菌體展示系統(tǒng)獲得的單鏈抗體具有免疫原性低、組織穿透力強(qiáng)、易到達(dá)靶細(xì)胞以及在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短、易解毒排出等優(yōu)點(diǎn)，使其在科研、診斷及治療方面應(yīng)用廣泛。該技術(shù)與傳統(tǒng)的雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)相比，其抗體的產(chǎn)量低，加之無(wú)法制備腹水,限制了其應(yīng)用[7]。噬菌體抗體技術(shù)的出現(xiàn)，結(jié)合一些新的表達(dá)載體的應(yīng)用，使豬源單克隆抗體以及抗體片段的制備變得更加便捷和有效[8-9]。本研究構(gòu)建了抗豬流行性腹瀉病毒的噬菌體單鏈抗體庫(kù)，經(jīng)過(guò)3輪“吸附-洗脫-富集”噬菌體抗體庫(kù)的選淘，得到抗豬流行性腹瀉病毒的單鏈抗體，可為豬流行性腹瀉的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 XLI-Blue感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自康為世紀(jì)公司；pComb3XSS載體由中國(guó)科學(xué)院微生物所惠贈(zèng)；限制性?xún)?nèi)切酶SfiI購(gòu)自美國(guó)NEB公司；T4DNA連接酶、Trizol、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA maker DL2000購(gòu)自Takara公司；M13K07購(gòu)自Invitrogen公司；豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的豬IgG重鏈(heavy chain，VH)(AK405798)和輕鏈Kappa鏈(EU683881)、輕鏈lamda鏈(AF345512)基因序列，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)可變區(qū)的特異性引物[10]，其中重鏈上游和輕鏈下游引入Linker接頭(斜體部分)，重鏈下游和輕鏈上游引入SfiⅠ的酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，序列及擴(kuò)增片段見(jiàn)表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的免疫及外周血淋巴細(xì)胞的提取 初次免疫以1 mL豬流行性腹瀉疫苗經(jīng)皮下注射免疫發(fā)病耐過(guò)豬,每次免疫間隔14 d，第3次免疫后14 d采集豬外周血液。取新鮮血液10 mL與全血及組織稀釋液1∶1～1∶2混勻，用豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒提取豬的外周血淋巴細(xì)胞。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞總RNA的提取 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Thermo Scientific NaNODROP2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及OD260/OD280值，并計(jì)算二者比值，分析其純度。

1.2.3 VH和VL基因的擴(kuò)增 采用RT-PCR法。以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增出VH和VL基因。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)； 72℃再延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收VH和VL片段。

1.2.4 SOE-PCR合成scFv基因 通過(guò)SOE-PCR方法將重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因VL組裝成scFv基因，形成VL-linker-VH。將得到的VH和VL的PCR產(chǎn)物等量的加入到體系中進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為：第一步為95℃ 5 min; 95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 40 s，共15個(gè)循環(huán)(不加引物)；第二步95℃ 5 min; 95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 40 s，共20個(gè)循環(huán)(加引物)；72℃再延伸10 min。

表1 重鏈及輕鏈目的片段擴(kuò)增引物

1.2.5 scFv片段與pComb3XSS載體的連接 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，用Sif I 分別對(duì)scFv片段和pComb3XSS載體進(jìn)行雙酶切，膠回收純化。將scFv酶切片段與pComb3XSS酶切片段進(jìn)行連接，反應(yīng)體體系為：insert DNA片段5.5 μL，10×buffer 1 μL，pComb3XSS 2.5 μL,0.4 U/μL T4 DNA ligase 1 μL,共10 μL，混勻后于16℃條件下連接16 h。

1.2.6 構(gòu)建scFv噬菌體抗體文庫(kù) 將200 μL的連接產(chǎn)物分10次與80 μL電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞在2.5 kV、800 Ω的條件下進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，每次電擊后加入1 mL的SOC培養(yǎng)基重懸，并轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，用100 μL菌液涂在含有Amp+(100 μg/mL)的平板，檢測(cè)抗體庫(kù)重組率，菌液加入氨芐和葡萄糖，待菌液OD600=0.5時(shí)，加入輔助噬菌體M13K07，37℃感染30 min后，繼續(xù)搖菌1 h,去除培養(yǎng)基，等體積換成含有終濃度Amp+(100 μg/mL)、Kana(50 μg/mL)和IPTG(0.1 mmol/mL)的培養(yǎng)基，搖菌6 h。離心收集上清，1∶5加入PEG8000，4℃過(guò)夜。48 h后離心，用PBS重懸,得到噬菌體單鏈抗體初級(jí)庫(kù)，用于噬菌體單鏈抗體庫(kù)的富集篩選。

1.2.7 噬菌體抗體展示文庫(kù)的鑒定 構(gòu)建的噬菌體單鏈抗體文庫(kù)分別用VH引物、VL引物和載體通用引物進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸 10 min。

1.2.8 噬菌體抗體展示文庫(kù)滴度的測(cè)定 取1 μL的單鏈?zhǔn)删w抗體初級(jí)庫(kù)，加入到999 μL的PBS中，混勻。從中取出10 μL加入到990 μL的PBS中進(jìn)行10倍比稀釋?zhuān)♂?～5個(gè)梯度。從每個(gè)稀釋度的液體中取出20 μL加入到180 μL OD600=0.5的菌液中感染15 min后，各取出20 μL涂布在含有Amp+(100 μg/mL)的平板上，計(jì)算噬菌體單鏈抗體文庫(kù)滴度。

1.2.9 噬菌體抗體展示文庫(kù)的篩選 用96孔微孔板法，抗原抗體結(jié)合篩選抗體庫(kù)，用0.1 mol/L的NaHCO3(pH9.6)稀釋抗原，濃度為100 μg/μL，100 μL/孔，至于4℃過(guò)夜，每孔加入100 μL封閉液放置37℃ 2 h，加入原始文庫(kù)的噬菌體100 μL/mL,吸附1 h，用PBST洗3～4遍，最后用Elution buffer洗脫，取20 μL測(cè)滴度，其余液體感染XLI-Blue感受態(tài)，擴(kuò)增噬菌體單鏈抗體文庫(kù)，進(jìn)行下一輪的選淘。第2、3輪噬菌體選淘，方法同上。

1.2.10 噬菌體抗體的鑒定 采用ELISA檢測(cè)抗體的結(jié)合活性。將篩選出來(lái)的噬菌體單鏈抗體文庫(kù)加入到已包被抗原的96孔酶標(biāo)板中，以HRP標(biāo)記的抗M13的抗體為酶標(biāo)二抗，M13K07為陰性對(duì)照，PBS為空白對(duì)照，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。將陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體擴(kuò)增后測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 重鏈及輕鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

擴(kuò)增的VH和VL基因經(jīng)濃度為10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見(jiàn)400 bp和350 bp的特異性片段，大小均與目的片段相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI和IMGT網(wǎng)站Blast比對(duì)，擴(kuò)增的片段與豬IgG重鏈和輕鏈序列同源性為100%，證明所擴(kuò)增的片段正確。

2.2 體外重組PCR構(gòu)建豬的scFv基因

將重鏈可變區(qū)VH與輕鏈可變區(qū)VL借助linker接頭連接，在體外形成VL-linker-VH的形式，構(gòu)建的目的條帶為780 bp，在電泳圖中的條帶與目的條帶相符(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.VH PCR產(chǎn)物；2.VL(Kappa鏈)PCR產(chǎn)物；3.VL(Lamda鏈)PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of VH；2.PCR products of VL(Kappa鏈)；3.PCR products of VL(Lamda鏈)

圖1 VH和VL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1 PCR products of VH and VL genes

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.VL(Kappa鏈)-linker-VH PCR產(chǎn)物；2.VL(Lamda鏈)-linker-VH PCR產(chǎn)物

M．DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of VL(Kappa)-linker-VH；3.PCR products of VL(Lamda)-linker-VH

圖2 scFv基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.2 PCR products of scFv gene

2.3 噬菌體抗體展示文庫(kù)的鑒定

構(gòu)建的文庫(kù)經(jīng)PCR分析，VH、VL和通用引物均被特異性擴(kuò)增。表明目的基因已連接在噬菌體載體上，條帶分別為VH400 bp，VL350 bp，scFv780 bp(圖3)。經(jīng)測(cè)定后，所構(gòu)建的原始文庫(kù)滴度為9.5×109pfu/mL。對(duì)隨機(jī)挑選的100個(gè)噬菌體菌落進(jìn)行PCR鑒定，重組率為90%。

2.4 scFv文庫(kù)的富集淘選

用96孔微孔板法抗原抗體結(jié)合篩選抗體庫(kù)。對(duì)噬菌體庫(kù)進(jìn)行了3輪“吸附-洗脫-富集”，并對(duì)每一輪的輸入和輸出噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定，經(jīng)過(guò)淘選，抗體庫(kù)的滴度比原始文庫(kù)高了80倍(表2)，有效富集了特異性較好的噬菌體，為下一步構(gòu)建完整抗體提供了參考。

M．DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1,VH PCR產(chǎn)物；2.VL(Kappa鏈) PCR產(chǎn)物；3.VL(Lamda鏈) PCR產(chǎn)物；4.VL(Kappa鏈)-linker-VH PCR產(chǎn)物；5.VL(Lamda鏈)-linker-VH的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of VH 2.PCR products of VL(Kappa) 3.PCR products of VL(Lamda) 4.PCR products of VL(Kappa)-linker-VH 5.PCR products of VL(Lamda)-linker-VH

圖3 噬菌體展示抗體文庫(kù)PCR鑒定

2.5 噬菌體抗體的鑒定

用ELISA方法，將篩選出來(lái)的噬菌體抗體加入到重組蛋白豬流行性腹瀉S蛋白包被的96孔酶標(biāo)板中，用HRP標(biāo)記的抗M13的抗體為酶標(biāo)二抗，M13K07為陰性對(duì)照，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450nm值。發(fā)現(xiàn)一株和豬流行性腹瀉S蛋白親和活性較好的噬菌體，其OD450nm值為0.762(圖4)，測(cè)序結(jié)果顯示該單鏈抗體輕、重鏈分別為VK1和VH1族,且序列順序?yàn)閂L-linker-VH，與我們構(gòu)建的單鏈抗體順序相同。

圖4 噬菌體抗體結(jié)合活性

3 討論

噬菌體抗體展示技術(shù)為基因工程抗體的高效篩選和定向改造提供了更高效的途徑。首先，隨著動(dòng)物免疫技術(shù)的發(fā)展空間將會(huì)變得越來(lái)越狹小，用體外方法篩選抗體將會(huì)越來(lái)越受到關(guān)注。噬菌體展示技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)抗體的靶動(dòng)物源化，減少抗體在使用過(guò)程中的抗抗體現(xiàn)象。其次，在養(yǎng)豬業(yè)，現(xiàn)有的豬流行性腹瀉疫苗無(wú)法全部防控該病的暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，所以研發(fā)抗豬流行性腹瀉病毒的單克隆抗體以及抗體類(lèi)藥物治療該病，是一種必然趨勢(shì)。

噬菌體展示技術(shù)在篩選抗體方面與傳統(tǒng)的單克隆抗體制備有所差異，該技術(shù)通過(guò)在噬菌體表面展示，與靶抗原結(jié)合，通過(guò)簡(jiǎn)單易行的96孔微孔板法，用抗原抗體結(jié)合，“吸附-洗脫-富集”大大縮減了篩選時(shí)間及步驟。

目前，豬源噬菌體抗體展示平臺(tái)較少，抗體分子量偏大，與抗原結(jié)合區(qū)域容易被封閉，且單鏈抗體的折疊能力有限，并且傳統(tǒng)單抗基本為鼠源抗體，在使用過(guò)程中容易產(chǎn)生抗抗體，影響其治療效果。本研究通過(guò)在豬抗體序列上設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，構(gòu)建出豬源抗豬流行性腹瀉病毒的scFv噬菌體抗體庫(kù)，并且在輕鏈的Kappa和Lamda鏈上分別設(shè)計(jì)引物，滿足抗體庫(kù)的多樣性，所構(gòu)建豬源噬菌體文庫(kù)量為9.5×109pfu/mL。理論上，若噬菌體文庫(kù)的原始庫(kù)量較小，會(huì)造成重鏈與輕鏈的自然配對(duì)減少或丟失，會(huì)出現(xiàn)低親和力的配組。本試驗(yàn)用XlI-Blue電轉(zhuǎn)感受態(tài)，較以往通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化建立噬菌體文庫(kù)提高了轉(zhuǎn)化效率，并通過(guò)多次電轉(zhuǎn)累積噬菌體庫(kù)量。在噬菌體篩選過(guò)程中，通過(guò)3輪的“吸附-洗脫-富集”的篩選，由于豬源抗體數(shù)量較多，特異性抗體所占比例不高，通過(guò)富集，最后的抗體庫(kù)滴度是原始抗體庫(kù)滴度的80倍，有利于富集特異性好的噬菌體單鏈抗體。但是其中有大量的抗體鏈丟失，最后導(dǎo)致結(jié)果只有少量的完整的VL-linker-VH,且與豬流行性腹瀉病毒親和性較高的只有一條噬菌體抗體鏈，這可能與ELISA抗原的包被量有關(guān)，我們調(diào)整抗原包被量以及優(yōu)化ELISA條件后，ELISA顯示的OD值有所上升，陽(yáng)性克隆數(shù)量增加，這與其他研究的結(jié)論相一致[11]。所以我們將會(huì)按照不同的連接方法構(gòu)建不同的抗體庫(kù)，來(lái)比較兩者的區(qū)別。我們用噬菌體展示技術(shù)篩選出噬菌體單鏈抗體，即使單鏈抗體有分子質(zhì)量小、組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其半衰期較短，抗體效價(jià)消失較快，不利于抗體在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮其治療作用。故本試驗(yàn)在制備噬菌體單鏈抗體的基礎(chǔ)上，通過(guò)噬菌體展示的方法縮短抗體篩選的時(shí)間，篩選得到抗豬流行腹瀉病毒抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)序列，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，將重鏈可變區(qū)與重鏈恒定區(qū)的CH1、CH2和CH3部分通過(guò)搭橋PCR的方法連接，同理將輕鏈可變區(qū)與輕鏈恒定區(qū)CL接連，得到完整的抗豬流行性腹瀉病毒完整的IgG抗體序列，為下一步構(gòu)建完整的單克隆抗體做準(zhǔn)備。本試驗(yàn)既可以得到抗豬流行性腹瀉病毒的單鏈抗體作為藥物治療，又可以在構(gòu)建單鏈抗體庫(kù)的基礎(chǔ)上獲得抗豬流行性腹瀉病毒的完整的IgG，可為豬流行性腹瀉的防治提供參考。