孫亞男 黃小波 粱 偉 陳文強(qiáng)

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100053)

衰老引起的血管老化在動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的一個(gè)始動(dòng)環(huán)節(jié)。PI3K-Akt是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路，在動(dòng)脈粥樣硬化病理過程中起著重要的作用。中醫(yī)認(rèn)為水谷精微由清化濁，變生痰濁，留滯脈絡(luò)之中，凝聚成塊，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素。而陳皮、半夏作為化痰對(duì)藥，為多數(shù)化痰復(fù)方的核心組成藥物，有化痰祛濕的功效。本課題組前期研究[1]證明其可以有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Klotho敲除小鼠是一種基因缺陷小鼠，有著衰老、動(dòng)脈硬化等特征。因此在本研究中使用陳皮、半夏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，研究陳皮、半夏是否通過調(diào)控PI3K-Akt通路、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-gal)而干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)Klotho敲除小鼠40只，C57BL/6小鼠10只，雄性，體質(zhì)量30～50 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。所有動(dòng)物飲水不限，自由攝食，光/暗各12 h。

1.2 陳皮、半夏湯制備

參照本課題組[1]前期研究結(jié)果，半夏、陳皮按照1∶1 的比例配伍。參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)，蒸餾水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，濾出，60 ℃恒溫箱內(nèi)24 h，水浴蒸發(fā)，調(diào)整濃度至1 g/mL(相當(dāng)于生藥1 g/mL)。并對(duì)pH值、衛(wèi)生學(xué)、比重等進(jìn)行檢測(cè)。4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用前搖勻。

1.3 血清制備

Klotho敲除小鼠使用陳皮-半夏湯劑灌胃，于末次給藥后1 h麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，室溫放置2 h，3 000 r /min 離心10 min，分離得到血清，56℃滅活30 min，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1Klotho敲除小鼠頸動(dòng)脈檢測(cè)

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：采用數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)：C57BL/6小鼠，6周齡(10只)；動(dòng)脈粥樣硬化衰老模型組(B組)：Klotho敲除小鼠(Klotho-/-)，6周齡(10只)；治療組(C組)：Klotho敲除小鼠，6周齡，陳皮、半夏干預(yù)治療(30只)，按照臨床用量的10倍(大劑量，20 g/kg)、5倍(中劑量， 10 g/kg)和、2.5倍(小劑量，5 g/kg)中藥用量，分為3個(gè)亞組，每組10只。其中，A組予基礎(chǔ)飼料喂飼；B、C組予高脂飼料喂飼；C組在高脂飼料喂飼基礎(chǔ)上使用陳皮、半夏灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)6周；A、B組使用等體積0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液灌胃。所有動(dòng)物飲水不限，自由攝食，光/暗各12 h，每周測(cè)體質(zhì)量一次。使用病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法抽樣檢驗(yàn)造模情況。

2)HE染色觀察頸動(dòng)脈病理改變：Klotho敲除小鼠，取相同部位頸總動(dòng)脈，置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，4℃，pH 7.4)的多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后以4 μm厚度切片，60～62℃烘箱(DHG-9140A型電熱恒溫箱)烤片2 h后行HE染色。每組每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取1張切片，觀察病理改變。

1.4.2 血漿MDA、SOD、SA-β-gal檢測(cè)

分離血清，檢測(cè)SOD、MDA。SOD活性檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法，在波長(zhǎng)550 nm處比色，按公式計(jì)算其活力，SOD活性以每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸單位。MDA檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法，在波長(zhǎng)532 nm處比色，按公式計(jì)算其含量。

檢測(cè)頸動(dòng)脈SA-β-gal。動(dòng)脈冰凍切片，置于新鮮配制的SA-β-gal孵育液中：X-gal 1 g/L，40 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 6.0、5 mmol/L K4Fe (CN)6、5 mmol/L K3Fe(CN)6、2 mmol/L MgCl2、150 mmol/L NaCl。37 ℃孵箱過夜，顯色，PBS沖洗，10 g/L中性紅復(fù)染胞核，油鏡下觀察。

1.4.3 Western blotting法測(cè)定頸動(dòng)脈PI3K與p-Akt表達(dá)

RIPA buffer裂解液提取總蛋白，考馬斯亮蘭法測(cè)蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性5 min，SDS- PAGE 電泳后半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST[0.05%(體積分?jǐn)?shù))的Tween-20]封閉1 h，一抗(兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗p-Akt，1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，二抗羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育1.5 h，β-actin為內(nèi)對(duì)照，洗膜，放射自顯影1 min，定影、晾干、掃描、圖像分析儀對(duì)顯影帶分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中藥陳皮、半夏對(duì)Klotho敲除小鼠頸動(dòng)脈病理變化的影響

正常對(duì)照組頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜完整，中膜為梭形平滑肌細(xì)胞。模型組有粥樣斑塊形成，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下有大量泡沫細(xì)胞堆積。陳皮半夏治療組內(nèi)膜也有輕度的增生，內(nèi)膜下有泡沫細(xì)胞形成，程度輕于模型組。隨著陳皮半夏用藥劑量的增加，動(dòng)脈粥樣硬化程度逐漸減輕。表明陳皮半夏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有一定的干預(yù)作用(圖1)。

2.2 中藥陳皮、半夏對(duì)Klotho敲除小鼠血漿MDA、SOD的影響

模型組與對(duì)照組的SOD、MDA、SA-β-gal值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模成功，詳見表1。

模型組SOD較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，MDA和SA-β-gal含量顯著升高(P<0.01)，表明動(dòng)物在衰老狀態(tài)。使用大劑量和中劑量陳皮、半夏干預(yù)后，SOD濃度較模型組有顯著上升(P<0.01)，MDA和SA-β-gal含量則顯著降低(P<0.01)，表明中藥陳皮、半夏能夠有效延緩動(dòng)脈衰老，詳見表2。

圖1 各組小鼠頸動(dòng)脈的病理變化Fig.1 Pathological changes of carotid artery in mice(HE staining，400×)

表1 對(duì)照組與模型組血漿SOD、MDA、頸動(dòng)脈SA-β-gal含量比較Tab.1 Level of SOD、MDA、SA-β-gal in control group and model group

表2 治療組與模型組血漿SOD、MDA、頸動(dòng)脈SA-β-gal含量比較Tab.2 Level of SOD、MDA、SA-β-gal in model group and citrus-pinellia group

2.3 中藥陳皮、半夏對(duì)Klotho敲除小鼠頸動(dòng)脈PI3K與p-Akt表達(dá)的影響

模型組中，PI3K和p-Akt表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)。陳皮、半夏治療組中各組PI3K和p-Akt表達(dá)均較模型組有下降。其中，大劑量和中劑量治療組中PI3K下降水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陳皮、半夏各治療組p-Akt表達(dá)均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明陳皮、半夏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物的PI3K和p-Akt水平有較好的調(diào)控作用(圖2)。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞的衰老、凋亡所引起的內(nèi)皮功能障礙在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起主要作用。血管的氧化應(yīng)激和內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙加速了血管衰老的進(jìn)展[2]。在基因缺失的小鼠中，內(nèi)皮細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙，提前出現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化，這使小鼠出現(xiàn)了早衰的表現(xiàn)和壽命的縮短[3]。Akt在血管重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制中起到主要作用，可以通過Akt信號(hào)傳導(dǎo)而增加細(xì)胞存活，在動(dòng)脈粥樣硬化中，Akt通過增加血管平滑肌細(xì)胞的增生和存活保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[4-5]。

圖2 頸動(dòng)脈PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)Fig.2 Expression of PI3K、Akt and p-Akt in carotid artery

△△P<0.01vscontrol group，**P<0.01vsmodel group，1：control group，2：model group，3：citrus-Pinellia high dose，4：citrus-pinellia medium dose，5：citrus-Pinellia low dose.

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是重要的細(xì)胞存激酶途徑。PI3K/Akt信號(hào)系統(tǒng)廣泛分布于多種細(xì)胞中，PI3K 通過對(duì)磷脂酰肌醇環(huán)上的3位羥基進(jìn)行磷酸化產(chǎn)生磷酸化的磷脂酰肌醇，并與Akt的PH 區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致Akt從細(xì)胞質(zhì)游離至細(xì)胞膜，并且構(gòu)象發(fā)生改變，在Ser473和Thr308位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，形成信號(hào)級(jí)聯(lián)復(fù)合物，然后通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，而發(fā)揮調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用[6]。PI3K/AKT信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞增長(zhǎng)、增生、粘附等多種生物學(xué)功能。PI3K被激活后，可招募并激活A(yù)KT，活化的AKT通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生及凋亡等過程[7]。

MDA升高可以直接反映其遭受了過度的氧化應(yīng)激損傷，反之則表明受到氧化應(yīng)激影響的程度減輕。SOD可以清除細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞維持氧化與抗氧化起重要作用。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD變化可以反映細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激的水平[8-10]。已有研究[11-12]證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加可引起細(xì)胞存活率下降，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞內(nèi)活性氧作為重要的細(xì)胞內(nèi)信使，活化AKT、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。SA-β-gal是衰老細(xì)胞的標(biāo)志之一，增加自由基的清除并有效抑制過度的氧化修飾可延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。目前，已有大量細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)[13-14]表明，抗氧化藥物是通過激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而上調(diào)SOD活性，起到抗氧化應(yīng)激的作用，有效防治細(xì)胞DNA氧化損傷、線粒體功能障礙、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用。

陳皮、半夏作為臨床常用的化痰對(duì)藥，具有燥濕化痰的功效，臨床應(yīng)用非常廣泛。陳皮長(zhǎng)于理氣健脾、燥濕化痰、為脾胃氣滯、胸脘痞滿及痰濕雍滯等常用之品，半夏善于燥濕化痰、降逆止嘔，為痰濕阻滯常用藥。二藥配伍入脾經(jīng)，半夏得陳皮之氣助則氣順而痰自消，化痰濕之力尤勝；陳皮得半夏之輔，則痰除而氣自下，理氣和胃的功效更顯著[15]?！短交菝窈蛣┚址健分杏卸悳?，可以充分體現(xiàn)二藥合用之功?，F(xiàn)有研究[16]表明，半夏和陳皮的主要成分分別是β-谷甾醇和陳皮苷，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血脂和防治高血壓等作用。這兩者均能抑制黃嘌呤氧化酶/次黃嘌呤體系中產(chǎn)生的超氧陰離子，其清除自由基的能力在一定濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增大而增強(qiáng)，β谷甾醇和陳皮苷都是良好的抗氧化劑，且能較好地清除自由基，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧，從而作用于AKT，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生和凋亡[11-12，17-20]。

本研究表明，陳皮、半夏治療能夠有效抑制動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚，且隨著劑量的增加抑制逐漸增強(qiáng)，動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚的程度逐漸減輕。SOD亦隨著陳皮、半夏劑量的增加而增加，相反，MDA隨其增加而降低，SA-β-gal含量也隨之降低。說明陳皮、半夏可能通過PI3K-Akt通路增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，從而達(dá)到控制細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成和加重，并且抑制效果與劑量的增加密切相關(guān)。

經(jīng)上述分析，筆者認(rèn)為陳皮、半夏可能通過PI3K/Akt通路，增加SOD水平，降低MDA、SA-β-gal水平而減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，從而延緩衰老形成。