唐林 彭穎 雷昌 喬勇 朱坤 夏新華

摘要：目的??優(yōu)選荊防小兒口服液的最佳提取工藝。方法??以苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率、升麻素苷轉(zhuǎn)移率、5-O-甲基維斯阿米醇苷轉(zhuǎn)移率、浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及信息熵理論考察加水量、提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果??荊防小兒口服液的最佳提取工藝條件為：加水量為10倍量，提取時(shí)間為1.0 h，回流提取2次。結(jié)論??本研究?jī)?yōu)選出的提取工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，可為荊防小兒口服液的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：荊防小兒口服液;正交試驗(yàn);提取工藝;信息熵

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.020

中圖分類號(hào)：R283.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2018）10-0091-05

Optimization of Extraction Process of Jingfang?Children Oral Liquid?with Orthogonal TestBased on Information Entropy Theory

TANG Lin¹， PENG Ying²， LEI Chang²， QIAO Yong²， ZHU Kun²， XIA Xin-hua²

1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 2. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective?To optimize the extraction process of Jingfang?Children Oral Liquid. Methods?Orthogonal test design and information entropy theory were?used to study the influence of water volume and extraction time on extraction process with transferring rates of amygdalin， prim-O-glucosylcimifugin?and?5-O-methylvisammioside， and extract yield as evaluation indexes. Results?The optimal?extraction process conditions were as follows： the ratio of water volume to raw materials weight was 10：1， extraction time was 1.0 h and extracted twice?under reflux. Conclusion?The optimal?extraction process is simple and stable， which can provide references for industrial production of Jingfang Children Oral Liquid.

Keywords：?Jingfang Children Oral Liquid; orthogonal test; extraction process; information entropy

荊防小兒口服液由荊芥、防風(fēng)、苦杏仁、生石膏等12味中藥組方制備而成，具有清熱解表、止咳化痰的功效，為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張滌教授經(jīng)驗(yàn)方，臨床用于治療小兒急性支氣管炎和小兒慢性支氣管炎的急性發(fā)作。防風(fēng)為方中君藥，色原酮類化合物升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷是其指標(biāo)成分，具有明顯的解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛作用^[1]。苦杏仁為方中臣藥，能降肺氣之上逆，可宣肺氣之郁滯，為止咳平喘之要藥，現(xiàn)代研究表明，其指標(biāo)成分苦杏仁苷具有抗炎、抗?jié)儭⒖狗卫w維化等藥理活性^[2]，可起到鎮(zhèn)咳平喘作用^[3]。由于升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷等成分均易溶于水^[4]，同時(shí)考慮到水煎的傳統(tǒng)提取方法，確定了本制劑的水提工藝。為進(jìn)一步確定該制劑合理的生產(chǎn)工藝，保證其臨床療效，本試驗(yàn)以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和苦杏仁苷的提取轉(zhuǎn)移率及浸膏得率為指標(biāo)綜合評(píng)分，采用正交試驗(yàn)法及信息熵理論對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，篩選該方的最佳提取工藝參數(shù)，為該制劑的中試放大及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 ?儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司;Hei-Vap Advantage（ML）型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph;AL-204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;SK-7200HP超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;SXKW數(shù)顯控溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;Purelab Option Q15超純水機(jī)（法國(guó)威立雅ELGA）。

飲片均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》各藥項(xiàng)下規(guī)定。對(duì)照品苦杏仁苷（批號(hào)110820-201506，純度93.4%）、升麻素苷（批號(hào)111522-201511，純度94.8%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)111523-201509，純度95.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?浸膏得率測(cè)定

精密量取水提樣品藥液25 mL（V₁），置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿（M₁）中，水浴蒸干，于105 ℃干燥5 h，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量（M₂），計(jì)算樣品的浸膏得率。浸膏得率=（M₂-M₁）V₂/m_總V₁。式中，m_總為水提藥液中藥材總質(zhì)量，V₂為水提藥液總體積。

2.2 ?指標(biāo)成分測(cè)定

2.2.1 ?苦杏仁苷含量測(cè)定

2.2.1.1 ?色譜條件

采用Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80），檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，記錄時(shí)間25 min。

2.2.1.2 ?對(duì)照品溶液的制備

精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品9.8 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為183.06 μg/mL的苦杏仁苷對(duì)照品溶液，于冰箱中冷藏備用。

2.2.1.3 ?供試品溶液的制備

精密量取水提樣品藥液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。

2.2.1.4 ?陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例稱取除苦杏仁外的其余飲片，加水提取2次，濃縮定容。精密量取濃縮液2 mL，按上述供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.2 ?升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量測(cè)定

2.2.2.1 ?色譜條件

采用Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，12%A;15～40 min，12%～28%A），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，記錄時(shí)間40 min。

2.2.2.2 ?對(duì)照品貯備液的制備

分別精密稱取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品14.5、15.4 mg，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，于冰箱中冷藏備用。

2.2.2.3 ?混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密量取升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品貯備液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為27.49、29.51 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2.4 ?供試品溶液的制備

精密量取水提藥液2 mL置離心管中，加入8 mL甲醇，充分搖勻，離心后取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干（60 ℃），殘?jiān)蛹状际谷芙?，加至中性氧化鋁柱（100?200目，4 g，內(nèi)徑1 cm）上，用50%乙醇20 mL洗脫，收集洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干（60 ℃），殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，備用。

2.2.2.5 ?陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例稱取除防風(fēng)外的其余飲片，加水提取2次，濃縮定容。精密量取濃縮液2 mL，按上述供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 ?方法學(xué)考察

2.2.3.1 ?專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下苦杏仁苷對(duì)照品溶液、供試品溶液、苦杏仁陰性對(duì)照溶液，及“2.2.2”項(xiàng)下升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、防風(fēng)陰性對(duì)照溶液，各10 μL，按上述相應(yīng)的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果表明供試品色譜中苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷與其他成分均分離良好（R>1.5），且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2.3.2 ?線性關(guān)系考察

分別精密量取苦杏仁苷對(duì)照品溶液（282.07 μg/mL）及升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對(duì)照品溶液（各取對(duì)照品貯備液5 mL，加甲醇定容至25 mL）1、2、4、6、8、10 μL，按上述相應(yīng)的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.3.3 ?精密度試驗(yàn)

分別精密量取苦杏仁苷對(duì)照品溶液及升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液各10 μL、按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)量記錄其峰面積，結(jié)果苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD分別為2.07%、2.02%、0.95%，表明儀器精密性良好。

2.2.3.4 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積積分值，結(jié)果苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD分別為1.16%、1.73%、1.69%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

2.2.3.5 ?重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取水提藥液2 mL，共12份，等分為2組，分別按“2.2.1.3”與“2.2.2.4”項(xiàng)下方法各制備6份供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算。結(jié)果樣品中苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷RSD分別為2.73%、2.84%、2.80%，表明本法重復(fù)性好。

2.2.3.6 ?加樣回收率試驗(yàn)

精密量取水提藥液1 mL，共6份，分別精密加入苦杏仁苷對(duì)照品溶液（612.70 μg/mL）1 mL;另精密量取水提藥液1 mL，共6份，分別精密加入升麻素苷對(duì)照品溶液（40.57 μg/mL）2 mL與5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液（41.39 μg/mL）1 mL。分別按上述色譜條件測(cè)定苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，計(jì)算得苦杏仁苷的平均回收率與RSD分別為99.20%、2.65%，升麻素苷的平均回收率與RSD分別為100.74%、2.61%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率與RSD分別為99.77%、1.98%，表明本法測(cè)定的準(zhǔn)確度高。

2.3 ?正交試驗(yàn)優(yōu)選水提工藝

本制劑處方由12味中藥組成，經(jīng)處方分析，確定對(duì)方中防風(fēng)等3味藥先采用蒸餾法提取揮發(fā)油^[5-6]，其藥渣再與苦杏仁等9味混合用水煎提。前期已對(duì)揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，本試驗(yàn)基于相關(guān)文獻(xiàn)^[7]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取加水量（A）、提取時(shí)間（B）為考察因素，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)水提工藝進(jìn)行研究。

2.3.1 ?正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按處方比例稱取飲片216 g，共9份，先采用蒸餾法提取防風(fēng)等3味藥的揮發(fā)油，其藥渣與苦杏仁等9味混合（其中苦杏仁于水沸后加入），用L₉（3⁴）正交表安排試驗(yàn)，加水回流提取2次，收集2次提取液并與提油后的藥渣濾液合并，濃縮定容至500 mL。分別按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的提取轉(zhuǎn)移率及浸膏得率。

2.3.2 ?水提工藝數(shù)據(jù)處理及分析

采用熵權(quán)法及專家咨詢法對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配，計(jì)算綜合評(píng)分。提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)多分為浸膏得率與有效成分轉(zhuǎn)移率兩類，其中有效成分轉(zhuǎn)移率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，而浸膏得率常作為參考指標(biāo)，本試驗(yàn)對(duì)有效成分轉(zhuǎn)移率與浸膏得率分別評(píng)定權(quán)重系數(shù)。采用專家建議將浸膏得率的權(quán)重系數(shù)定為0.1，有效成分轉(zhuǎn)移率的總權(quán)重系數(shù)定為0.9。

根據(jù)文獻(xiàn)方法^[7-8]將有效成分建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣（X），將原始矩陣轉(zhuǎn)換為概率矩陣（P），計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)（苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率、升麻素苷轉(zhuǎn)移率和5-O-甲基維斯阿米醇苷轉(zhuǎn)移率）的信息熵（H_i），計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)（W_i）。

有效成分轉(zhuǎn)移率總權(quán)重系數(shù)為0.9，則修正后第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)（W_i*）=W_i×0.9=[0.738?8??0.107?8 ?0.053 4]。

對(duì)于1個(gè)m行n列的概率矩陣，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)M_m=P_1mW₁+P_2mW₂+P_3mW₃+…+P_nmW_n，即苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率、升麻素苷轉(zhuǎn)移率、5-O-甲基維斯阿米醇苷轉(zhuǎn)移率及浸膏得率的權(quán)重系數(shù)依次為0.74、0.11、0.05、0.10。

對(duì)概率矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，得到綜合評(píng)分。綜合評(píng)分=苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率÷苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率_max×0.74+升麻素苷轉(zhuǎn)移率÷升麻素苷轉(zhuǎn)移率_max×0.11+5-O-甲基維斯阿米醇苷轉(zhuǎn)移率÷5-O-甲基維斯阿米醇苷轉(zhuǎn)移率_max×0.05+浸膏得率÷浸膏得率_max×0.1。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由直觀分析可以看出，A因素各水平的K值依次為K3>K2>K1、B因素各水平的K值依次為K3≈K2>K1，對(duì)總的提取效果的影響為B>A;方差分析顯示，A、B兩因素的影響均有顯著性。綜合上述分析，從縮短生產(chǎn)時(shí)間和減少能耗等角度考慮，由于B₂與B₃的K值差別很小，可選B₂。因此，確定最優(yōu)提取工藝方案為A₃B₂，即加10倍量水，提取1.0 h。

2.3.3 ?驗(yàn)證試驗(yàn)

參照“2.3.1”項(xiàng)下提取工藝，按上述優(yōu)選的最佳工藝方案A₃B₂，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表4。該方案與正交試驗(yàn)表中相同試驗(yàn)方案（即綜合評(píng)分最高的8號(hào)試驗(yàn)）結(jié)果相近，苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率、升麻素苷轉(zhuǎn)移率、5-O-甲基維斯阿米醇苷轉(zhuǎn)移率、浸膏得率RSD分別為1.00%、1.05%、0.92%、2.77%，說(shuō)明該工藝條件合理可行，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.3.4 ?提取次數(shù)考察

在上述正交驗(yàn)證試驗(yàn)水提2次完成后，向藥渣中加入10倍量水，提取1.0 h，濃縮定容至500 mL，即得第3次提取液。按上述方法分別測(cè)定苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的提取轉(zhuǎn)移率及浸膏得率。結(jié)果表明，第3次提取液中苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率、浸膏得率分別為6.28%、2.22%，升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷的轉(zhuǎn)移率幾乎為0。4個(gè)指標(biāo)所占3次提取率的比率均小于10%，故從降低生產(chǎn)成本角度考慮，以提取2次為宜。

3 ?討論

本試驗(yàn)曾考慮將升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和苦杏仁苷用同一HPLC條件進(jìn)行檢測(cè)，但發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷與升麻素苷的色譜峰存在陰性干擾，故參照藥典及文獻(xiàn)方法^[9-11]在2種不同的HPLC條件下分別對(duì)上述3種成分進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定苦杏仁苷時(shí)，發(fā)現(xiàn)流速與柱溫對(duì)其分離影響不大，而采用適宜的色譜柱并調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例可顯著改善苦杏仁苷的分離效果，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。測(cè)定升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷時(shí)，采用中性氧化鋁柱對(duì)水提藥液進(jìn)行純化，可消除雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾。

本試驗(yàn)前期曾對(duì)苦杏仁進(jìn)行了冷水加熱提取與沸水直接提取的比較。結(jié)果表明，苦杏仁于水沸后加入能顯著增加苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率^[12]，可能是“殺酶保苷”的效果。

采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選中藥制劑提取工藝時(shí)，常涉及“提取次數(shù)”的問(wèn)題。文獻(xiàn)報(bào)道常將其作為“正交試驗(yàn)”的考察因素，筆者認(rèn)為這樣不妥。因?yàn)檎辉O(shè)計(jì)要求各因素之間必須獨(dú)立，否則將影響其他因素的分析結(jié)果^[13]。而提取次數(shù)為非獨(dú)立變量，其變化同時(shí)伴隨總的提取溶劑用量與提取時(shí)間的變化，其改變對(duì)提取效果的影響主要由總的提取溶劑用量與提取時(shí)間發(fā)生較大改變所致，因而對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，“提取次數(shù)”通常表現(xiàn)為具有顯著影響，其他因素的影響則不顯著^[14-15]，故將“提取次數(shù)”納入正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行考察，會(huì)掩蓋其他提取工藝因素的顯著性分析結(jié)果，進(jìn)而影響提取工藝優(yōu)化結(jié)果的可靠性。因此，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)避免將“提取次數(shù)”納入考察因素的選擇。

本試驗(yàn)選擇方中多個(gè)活性成分的轉(zhuǎn)移率和浸膏得率作為提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，符合中藥復(fù)方多成分多靶點(diǎn)起效的特點(diǎn)。各指標(biāo)間的客觀賦權(quán)一直困擾著中藥提取工藝的綜合評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法多采用專家咨詢法，具有一定的主觀性^[16]，信息熵理論基于對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的充分分析，減少了主觀因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾^[17]，但往往忽略了中藥提取工藝的實(shí)際情況，如浸膏得率常作為中藥提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但一般不作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，故本試驗(yàn)將專家咨詢法與信息熵理論相結(jié)合應(yīng)用于多指標(biāo)的綜合分析，提升了本試驗(yàn)研究的嚴(yán)謹(jǐn)性及合理性。另外，將提取次數(shù)置于驗(yàn)證試驗(yàn)中進(jìn)行考察，可避免其對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的干擾，既保證了提取工藝考察數(shù)據(jù)的科學(xué)性，又可保證其完整性。優(yōu)化后的提取工藝結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為該處方的工業(yè)化生產(chǎn)及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供重要依據(jù)，同時(shí)也可為今后中藥提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素選擇提供參考。

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