馬學(xué)梅，李凌軍，謝慧超，高爽，王玉真，容蓉，楊勇

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

麻黃細(xì)辛附子湯[1]出自東漢張仲景的《傷寒論》，具有扶正解表、溫經(jīng)解表之功效。麻黃發(fā)汗散寒，細(xì)辛解表散寒，附子補(bǔ)火助陽(yáng)，三藥合煎共治陽(yáng)虛外感之癥[2]。近年來(lái)，臨床上有研究報(bào)道稱使用該方的三味藥引起中毒和不良反應(yīng)，煎煮不當(dāng)是其中的一個(gè)重要原因[3]。中醫(yī)臨床上常采用久煎的手段來(lái)降低附子烏頭堿毒性，但長(zhǎng)時(shí)間煎煮藥理活性也逐漸減弱或消失[4-6]，細(xì)辛脂素水煎液溶出量低[7]也對(duì)全方提取帶來(lái)困難。因此，全方煎煮時(shí)間的控制是建立規(guī)范化煎煮工藝的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯柯辄S細(xì)辛附子湯全方水提工藝麻黃中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛中的細(xì)辛脂素以及附子中的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的提取含量動(dòng)態(tài)變化，為提取工藝的設(shè)計(jì)及優(yōu)化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Technologies 1260 Series高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；BS110S分析天平(北京賽多利斯公司)；New Classic MC 十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)；IKA RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的麻黃(批號(hào)：130315)購(gòu)自泰山中藥有限公司；細(xì)辛(批號(hào)：16050202)購(gòu)自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司；黑順片(批號(hào)：151008)購(gòu)自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司。經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定，麻黃為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf.的干燥草質(zhì)莖；細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFi.Schmidt var.mandshuricumKittag.的干燥根及根莖；黑順片為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，按照《中國(guó)藥典》2015年版[8]相關(guān)項(xiàng)下要求檢查均符合規(guī)定。

鹽酸麻黃堿(純度99.8%，批號(hào)：171241-201508)、鹽酸偽麻黃堿(純度99.8%，批號(hào)：171237-201509)、苯甲酰新烏頭原堿(純度96.3%，批號(hào)：111795-201303)、苯甲酰烏頭原堿(純度97.5%，批號(hào)：111794-201304)、苯甲酰次烏頭原堿(純度94.6%，批號(hào)：111796-201304)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所；細(xì)辛脂素(純度98%，批號(hào)：Z21D6B7491)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同提取時(shí)間煎液的制備

分別稱取麻黃25 g，細(xì)辛25 g，黑順片50 g各6份，粉碎為最粗粉，加10倍量水浸泡30 min，分別以20、40、60、90、120、150 min為提取時(shí)間節(jié)點(diǎn)。藥液經(jīng)2層紗布濾過(guò)，分別減壓濃縮至l mL藥液含1 g復(fù)方飲片，標(biāo)記備用。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品適量，加甲醇制備成濃度分別為0.540 0、0.410 0 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密移取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿儲(chǔ)備液置于同一50 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，得濃度0.108 0、0.082 0 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ。

精密稱取細(xì)辛脂素對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶，乙腈稀釋至刻度，得濃度0.235 0 mg·mL-1的細(xì)辛脂素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量，加甲醇制備成濃度分別為0.222 3、0.219 0、0.217 7 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液置同一10 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，得濃度0.066 7、0.065 7、0.065 3 mg·mL-1的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ。

2.2.2 供試品溶液制備

分別精密移取2.1項(xiàng)下各組濃縮液適量，蒸干后用1.44%磷酸水溶液制備成0.012 g·mL-1的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的供試品溶液a1～6。

分別精密移取2.1項(xiàng)下各組濃縮液適量，蒸干后用70%甲醇制備成0.6 g·mL-1的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為細(xì)辛脂素的供試品溶液b1～6。

2.3 色譜條件

2.3.1 測(cè)定麻黃中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的色譜條件

Ultimate Phenyl-Ether 2901.07(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1 mL·min-1,柱溫30 ℃，鹽酸麻黃堿的保留時(shí)間為8 min，鹽酸偽麻黃堿的保留時(shí)間為10 min，相關(guān)色譜峰見圖1～2。

圖1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances I

圖2 供試品溶液a1色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample a1

2.3.2 測(cè)定細(xì)辛中細(xì)辛脂素的色譜條件

Kromasil 100-5-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為乙腈，B為純水，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，細(xì)辛脂素的保留時(shí)間為24.00 min，相關(guān)色譜峰見圖3～4。

圖3 細(xì)辛脂素對(duì)照品儲(chǔ)備液色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of reference substances of asarinin

圖4 供試品溶液b1色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of sample b1

2.3.3 測(cè)定附子中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的色譜條件

1苯甲酰新烏頭原堿；2 苯甲酰烏頭原堿；3 苯甲酰次烏頭原堿圖5 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ色譜圖Fig.5 HPLC Chromatogram of reference substancesⅡ

1苯甲酰新烏頭原堿；2 苯甲酰烏頭原堿；3 苯甲酰次烏頭原堿圖6 供試品溶液c1色譜圖Fig.6 HPLC Chromatogram of sample c1

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍

精密移取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ，制備成濃度分別為0.091 8/0.069 7、0.075 6/0.057 4、0.059 4/0.045 1、0.043 2/0.032 8、0.027 0/0.020 5、0.010 8/0.008 2 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿/鹽酸偽麻黃堿混合對(duì)照品溶液。

精密移取2.2.1項(xiàng)下制備的細(xì)辛脂素對(duì)照品儲(chǔ)備液，制備成濃度分別為0.235 0、0.199 8、0.164 5、0.129 3、0.094 0、0.058 9 mg·mL-1的細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液。

精密移取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ，制備成濃度分別為0.066 7/0.065 7/0.065 3、0.053 3/0.052 5/0.052 3、0.040 0/0.039 4/0.039 2、0.026 7/0.026 3/0.026 1、0.013 3/0.013 1/0.013 1、0.003 3/0.003 3/0.003 3 mg·mL-1的苯甲酰新烏頭原堿/苯甲酰烏頭原堿/苯甲酰次烏頭原堿混合對(duì)照品溶液。

進(jìn)樣20.00 μL測(cè)定，記錄峰面積。分別以各成分峰面積為縱坐標(biāo)y，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)x，得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿回歸方程，分別為y1=46 423x-2.970 5,r=0.999 9,n=6;y2=50 483x+10.722,r=0.999 9,n=6;y3=26 017x+91.474,r=0.999 7,n=6;y4=20609x+15.538,r=0.999 8,n=6;y5=26 475x+15.012,r=0.999 7,n=6;y6=20 544x+2.134 8,r=0.999 9,n=6。鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿線性范圍分別為0.216 0～1.836 0 μg、0.164 0～1.394 0 μg、1.175 0～4.700 0 μg、0.066 7～1.333 4 μg、0.065 7～1.313 2 μg、0.066 5～1.306 6 μg。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品Ⅰ、細(xì)辛脂素對(duì)照品、混合對(duì)照品Ⅱ稀溶液，分別按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)分別為0.60%、0.24%、0.26%、2.45%、2.26%、1.89%，表明該儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密移取2.2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，按2.3.1、2.3.2、2.3.3項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)分別為0.60%、1.52%、0.73%、1.19%、2.70%、0.67%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密移取2.1項(xiàng)下制備的溶液，分別按照2.2.2項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)分別為0.14%、0.05%、1.65%、2.35%、2.41%、2.36%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密移取2.1項(xiàng)下已知含量的同一供試品溶液18份，分成3組，分別精密加入2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ、細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ適量，再按照2.2.2項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液。分別按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的平均回收率(n=6)分別為99.05%、97.01%、98.55%、103.71%、97.61%、102.98%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.5 樣品含量測(cè)定

精密移取2.1項(xiàng)下制備的各組溶液，分別按照2.2.2項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，按照2.3.1、2.3.2、2.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算每克生藥中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、細(xì)辛脂素、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同煎煮時(shí)間活性成分含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of active ingredients in different decocting time

2.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析中雙因素分析法對(duì)各成分不同提取時(shí)間溶出量進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=2.773，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為各成分在各煎煮時(shí)間點(diǎn)溶出量有顯著性差異。

按照《中國(guó)藥典》[8]項(xiàng)下要求對(duì)藥材進(jìn)行含量測(cè)定，根據(jù)轉(zhuǎn)移率%=供試品含量/藥材含量，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得各藥材的轉(zhuǎn)移率，見圖7 。

圖7 麻黃生物堿、細(xì)辛脂素、附子單酯型生物堿轉(zhuǎn)移率曲線圖Fig.7 Transfer curves of ephedrine alkaloids, asarone and monactone alkaloids

對(duì)于麻黃中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)移率的拐點(diǎn)在90 min達(dá)到91.65%。20 min時(shí)轉(zhuǎn)移了76.00%，是因?yàn)榧逯髸r(shí)間較短，有效成分溶出量相對(duì)較少；然后在20～90 min之前轉(zhuǎn)移率逐步上升，90～120 min轉(zhuǎn)移率上升趨勢(shì)較緩。120 min之后溶出量反而有所下降。

細(xì)辛中細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率的拐點(diǎn)也在90 min，為23.47%。在提取前20 min細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率僅達(dá)11.36%，然后在20～90 min之間轉(zhuǎn)移率逐步上升，到90 min時(shí)，溶出量達(dá)最大。90 min后，細(xì)辛脂素溶出總量開始降低。90～120 min細(xì)辛脂素總量減少速度較快，120～150 min消減速度有所減慢，但仍是消減趨勢(shì)。

附子中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總?cè)艹隽吭?0 min時(shí)轉(zhuǎn)移率達(dá)到70.03%，在20～90 min附子單酯型生物堿的溶出量在緩慢上升，轉(zhuǎn)移率最高達(dá)77.03%，之后開始下降。

3 結(jié)論與討論

中藥傳統(tǒng)湯劑在煎煮過(guò)程中，煎煮時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)煎液的質(zhì)量有非常重要的影響[9]，選擇合適的煎煮時(shí)間對(duì)提高藥物的臨床療效有現(xiàn)實(shí)意義。藥材中有些成分相互之間或與細(xì)胞壁之間，存在一定的親和性而有相互吸附的作用。溶劑進(jìn)入藥材要先解除吸附，才能使有效成分分散于溶劑中。有效成分不斷溶出使細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)濃度差和滲透壓差，促使有效成分溶出。煎煮時(shí)間太短，有效成分溶出不完全；反之，長(zhǎng)時(shí)間煎煮可能會(huì)導(dǎo)致大量雜質(zhì)溶出，某些有效成分分解或者轉(zhuǎn)化，含量減少。因此，要根據(jù)藥物的質(zhì)地、有效成分性質(zhì)等因素選擇合適的煎煮時(shí)間[10]。

附子水煎液中生物堿含量低，成分復(fù)雜，測(cè)定方法[11-13]常有相鄰峰和“假陽(yáng)性峰”的干擾。在固相萃取中，固相對(duì)分離物的吸附力比溶解分離物的溶劑更大。當(dāng)樣品溶液通過(guò)吸附劑床時(shí)，附子生物堿濃縮在其表面，其他樣品成分通過(guò)吸附劑床。通過(guò)只吸附生物堿而不吸附其他樣品成分的吸附劑，可以得到高純度和濃縮的附子生物堿。采用陽(yáng)離子交換固相萃取柱對(duì)附子煎液進(jìn)行富集和精制[14]，獲得了理想的效果，各成分達(dá)到基線分離，提高了測(cè)定方法的適用性和準(zhǔn)確度。

麻黃中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為仲胺生物堿，堿性較強(qiáng)。由于偽麻黃堿的共軛酸會(huì)形成分子內(nèi)氫鍵，穩(wěn)定性大于麻黃堿，所以偽麻黃堿的堿性強(qiáng)于麻黃堿。二者的分子較小，既可溶于水，又可溶于氯仿，但偽麻黃堿在水中的溶解度較麻黃堿小，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果也是鹽酸麻黃堿先于鹽酸偽麻黃堿出峰，與文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致。在煎煮過(guò)程中，隨著時(shí)間變化二者溶出量的比值(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.42%,n=6)可認(rèn)為差異不顯著。麻黃堿類90 min時(shí)轉(zhuǎn)移率已經(jīng)達(dá)到91.65%，溶出量高。

細(xì)辛脂素呈游離型，偏親脂性，難溶于水，所以其在水里的溶解度是有限的，而濃度梯度對(duì)提取有顯著影響。因此，當(dāng)細(xì)辛脂素達(dá)到溶解平衡后，由于濃度梯度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，增加提取時(shí)間不能提高提取率。有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，在中藥復(fù)方水煎液中細(xì)辛脂素含量和單味藥水煎液的含量存在顯著性差異。這說(shuō)明復(fù)方配伍能夠通過(guò)增溶原理增加細(xì)辛脂素的溶解度?？紤]在后期提取中，細(xì)辛可以通過(guò)增加煎煮次數(shù)來(lái)提高細(xì)辛脂素的溶出量。

附子單酯型生物堿含量隨著煎煮時(shí)間延長(zhǎng)先增后降，這與其他報(bào)道[17]相吻合。一般報(bào)道稱附子雙酯型生物堿是毒效成分[18]，為了進(jìn)一步了解附子各生物堿的轉(zhuǎn)化情況可對(duì)雙酯型生物堿做進(jìn)一步考察。

以上數(shù)據(jù)及曲線有不規(guī)則的地方，除了實(shí)驗(yàn)誤差外，認(rèn)為還有中藥煎煮過(guò)程中各種復(fù)雜成分相互交錯(cuò)影響的原因[19-21]，但是并不影響從中得出趨勢(shì)。本方中三味藥在煎煮20 min時(shí)有效成分溶出明顯低于其他煎煮時(shí)間，然后在90 min時(shí)有明顯增加，之后出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)，120 min后出現(xiàn)消減現(xiàn)象。說(shuō)明久煎并不能使有效成分絕對(duì)增加，長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)使有些成分發(fā)生分解或者轉(zhuǎn)化，具體轉(zhuǎn)化情況有待進(jìn)一步研究分析。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出麻黃細(xì)辛附子湯合煎90 min時(shí)6種活性成分穩(wěn)定存在，同時(shí)也使溶出量達(dá)到峰值。此外，藥材粒度與加水量對(duì)有效物質(zhì)提取的影響亦較大，為進(jìn)一步增加有效成分溶出總量及提高溶出速度，下一步可對(duì)藥材粒度、加水量進(jìn)行考察。