吳曉暢 王領(lǐng) 張娜 趙福濤

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（上海 201999）

干燥綜合征是一種主要侵犯外分泌腺的自身免疫性疾病，能導(dǎo)致口干、眼干及內(nèi)臟系統(tǒng)損害等臨床表現(xiàn)［1］。該病發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量。其病理特征為外分泌腺大量淋巴細(xì)胞浸潤及實(shí)質(zhì)組織細(xì)胞破壞；血清中多種炎性因子水平升高，并參與到疾病發(fā)展過程［2］。因此，抑制炎性細(xì)胞浸潤外分泌，抑制炎性因子產(chǎn)生及作用通路是治療該病的關(guān)鍵，但目前針對(duì)該病治療上主要以對(duì)癥治療為主，目前有效治療的藥物有限。艾拉莫德作為一種具有新的抗炎和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)小分子藥物，已用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，根據(jù)作用機(jī)制臨床上也在試用于治療其它多種風(fēng)濕病，包括干燥綜合征［3］，且收到了確切療效，但缺乏基礎(chǔ)研究的支持。本研究擬在通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究艾拉莫德對(duì)于干燥綜合征模型（NOD）小鼠的作用，從而探討艾拉莫德的有效性及可能機(jī)制，為其治療SS提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡NOD雌性小鼠，18只，SPF級(jí)，平均體重為18～20 g；7周齡C57BL/6雌性小鼠，6只，SPF級(jí)；采購于中國上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：2015000533754/2015000526399。生產(chǎn)許可證號(hào)碼為：SCXK（滬）2012?0002。

1.1.2試劑（1）羧甲基纖維素鈉為美國Sigma公司；艾拉莫德原藥（商品名：艾得辛）先聲藥業(yè)提供，批號(hào)：A17?160903；3%戊巴比妥鈉由實(shí)驗(yàn)中心配制；0.1M枸櫞酸緩沖液、4%多聚甲醛、PBS緩沖液均購自中國上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；（2）IL?17 ELISA試劑盒、IFN?γ ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；（3）伊紅染液、蘇木素染液均購自中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組選取8周齡雌性NOD小鼠18只，隨機(jī)分成3組（6只/組）：模型組、艾拉莫德干預(yù)1組、艾拉莫德干預(yù)2組；雌性C57BL/6小鼠6只，作為正常對(duì)照組；均喂養(yǎng)于無特殊病菌的恒溫條件下，飲水瓶給水。至第10周齡時(shí)（實(shí)驗(yàn)第0天），艾拉莫德1組每只予10 mg/kg艾拉莫德灌胃治療；艾拉莫德2組予30 mg/kg艾拉莫德灌胃治療；模型組和正常對(duì)照組每只小鼠等體積0.5%羧甲基纖維素灌胃，每天固定時(shí)間點(diǎn)灌胃1次。給藥量按動(dòng)物與人等效劑量換算表計(jì)算得出。

1.2.2進(jìn)食量、飲水量、體重變化量測量每2天固定時(shí)間點(diǎn)測量一次小鼠進(jìn)食量（投喂重量-剩余重量，單位：g/組）、飲水量（給水重量-剩余重量，單位：g/組）、體重（單位：g/組），直至鼠齡16周停止。

1.2.3血清IL?17、IFN?γ測定16周齡時(shí)處死小鼠，并眼球取血，常規(guī)分離血清，凍存于-80℃冰箱中，同批以ELISA測定血清中IL?17、IFN?γ水平，按照試劑盒說明書操作。450 nm讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取各組血清標(biāo)本因子含量。

1.2.4頜下腺組織學(xué)觀察將小鼠處死后，取小鼠頜下腺組織，置于10%多聚甲醛中固定，組織脫水、透明化、浸蠟和包埋，以4 μm厚度切片；將制作好的組織切片用蘇木素一伊紅（HE）染色，切片常規(guī)脫蠟，水化，染色，脫水、透明、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠頜下腺組織病理形態(tài)學(xué)等的變化。根據(jù)Chisholm?Mason等提出的腺體活檢分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)：（2級(jí)以上為發(fā)病）。0級(jí)：未見淋巴細(xì)胞浸潤；1級(jí)：少量淋巴細(xì)胞浸潤；2級(jí)：淋巴細(xì)胞中度浸潤；3級(jí)：偶有0～1個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤灶/5個(gè)低倍鏡視野，伴有中度實(shí)質(zhì)損傷；（淋巴細(xì)胞浸潤灶：指4 mm2組織內(nèi)至少有50個(gè)淋巴細(xì)胞聚集于腺體間質(zhì)者為一個(gè)灶）；4級(jí)：易見2～3個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤灶/5個(gè)低倍鏡視野，伴有重度實(shí)質(zhì)損傷。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad prism 5和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)按統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本間比較采用單因素方差分析以及兩組間Dunnett′s T3檢驗(yàn)對(duì)比分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1艾拉莫德干預(yù)前后各組飲水量、進(jìn)食量、體質(zhì)量變化情況飲水量：如圖1-A，飲水量在正常對(duì)照組基本保持不變，在模型組保持較高水平維持，而從實(shí)驗(yàn)第1天起，艾拉莫德1組和艾拉莫德2組給予干預(yù)后，飲水量都有明顯減少，與模型組相比均有顯著降低（P＜0.05）。進(jìn)食量：如圖1-B，進(jìn)食量在正常對(duì)照組基本保持不變，且進(jìn)食量正常；模型組隨著鼠齡增大小鼠疾病進(jìn)展，進(jìn)食量逐漸降低；因艾拉莫德1組和艾拉莫德2組給予艾拉莫德干預(yù)，進(jìn)食量出現(xiàn)輕度降低后又逐漸出現(xiàn)升高趨勢(shì)，與模型組相比有顯著升高（P＜0.05）。體質(zhì)量：如圖1-C，體質(zhì)量在正常對(duì)照組隨著鼠齡增大保持輕度增高趨勢(shì)，但基本保持平穩(wěn)，在模型組隨著鼠齡增大小鼠疾病進(jìn)展，體質(zhì)量逐漸降低；因艾拉莫德1組和艾拉莫德2組給予干預(yù)后，體質(zhì)量都有恢復(fù)并輕度增高，與模型組相比均有顯著升高（P＜0.05）（圖1）。

2.2血清IL?17、IFN?γ濃度變化情況艾拉莫德干預(yù)干燥綜合征模型小鼠后，ELIAS測各組血清炎性因子IL?17、IFN?γ水平，其中，IL?17水平在艾拉莫德2組較模型組有減低，差異有顯著性意義（P＜0.01）；艾拉莫德2組與艾拉莫德1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；由可得出艾拉莫德劑量增加，炎性因子IL?17降低更明顯。而IFN?γ水平在各組中的水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖1 艾拉莫德干預(yù)對(duì)各組飲水量、進(jìn)食量、體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of Iguratimod on water intake（A）、food intake（B）and body weight（C）

2.3 頜下腺組織病理分級(jí)情況空白組16周齡C57BL/6小鼠均在Chisholm組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的0級(jí)；模型組16周齡NOD小鼠均在組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的3～4級(jí)；艾拉莫德1組NOD小鼠在組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的2～4級(jí)；艾拉莫德2組NOD小鼠主要在組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的1級(jí)。與正常對(duì)照組比較，模型組頜下腺組織淋巴細(xì)胞浸潤明顯，呈現(xiàn)灶性分布，外分泌腺結(jié)構(gòu)破壞，腺管擴(kuò)張，腺泡萎縮，而艾拉莫德1組（10 mg/kg）與艾拉莫德2組（30 mg/kg）小鼠頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤程度較模型組有明顯減少，頜下腺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕。對(duì)頜下腺組織病理分級(jí)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，艾拉莫德2組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3～5）。

圖2 艾拉莫德干預(yù)對(duì)NOD小鼠血清IL?17、IFN?γ濃度的影響（pg/mL± s）Fig.2 Effect of Iguratimod on serum IL?17、IFN?γ concentration in NOD mice

3 討論

干燥綜合征有著復(fù)雜的體液和細(xì)胞免疫異常，病理顯示為外分泌腺的大量炎性細(xì)胞浸潤，形成浸潤灶，對(duì)腺體的結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生破壞。特別是T淋巴細(xì)胞，以及由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種炎性因子，導(dǎo)致外分泌腺分泌功能的缺失，出現(xiàn)口干、眼干以及內(nèi)臟器官受損表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。近年來，對(duì)浸潤性T細(xì)胞進(jìn)行了廣泛的研究，特別是以浸潤性CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞，T細(xì)胞及其特異性細(xì)胞因子在外分泌腺中顯著增多，提示其在干燥綜合征發(fā)病機(jī)制中起到重要作用［2］，其中IL?17、IFN?γ通過多種炎性通路影響干燥綜合征疾病病理過程，為發(fā)病過程中重要的影響因子。其中，細(xì)胞因子IFN?γ是人類免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［4］。在pSS患者眼結(jié)膜及唾液腺組織中發(fā)現(xiàn) IFN?γ mRNA以及血清IFN?γ的高表達(dá)，并且其與T細(xì)胞浸潤程度相關(guān)［5］。IFN?γ在干燥綜合征模型和人類外分泌腺組織結(jié)構(gòu)和分泌功能的破壞中起到至關(guān)重要的作用，可能與其誘導(dǎo)外分泌腺細(xì)胞凋亡、死亡和組織結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)［6］；IFN?γ調(diào)節(jié)趨化因子配體通路，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞在靶器官中聚集，啟動(dòng)異常免疫反應(yīng)［7］。

圖4～5 艾拉莫德干預(yù)對(duì)NOD小鼠頜下腺組織病理分級(jí)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)Fig.4～5 Effect of Iguratimod on salivary gland pathology grade in NOD mice

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，CD4+記憶效應(yīng)T細(xì)胞亞群Th17家族，包括6個(gè)成員，特別是IL?17A能夠起始強(qiáng)大炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)產(chǎn)生潛在的前炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)［8］。在實(shí)驗(yàn)性干燥綜合征小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，IL?17A敲除的小鼠未表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀和組織病理學(xué)改變，而將Th17細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至IL?17A敲除的小鼠體內(nèi)，迅速誘導(dǎo)出SS樣癥狀，且IL?17A能有效驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞的激活和成熟，最終導(dǎo)致抗體反應(yīng)的增強(qiáng)［9］。IL?17A與淋巴細(xì)胞浸潤程度和臨床參數(shù)相關(guān)，隨著淋巴細(xì)胞浸潤程度的增加，IL?17A的密度增加。IL?17+單核細(xì)胞在導(dǎo)管周圍浸潤程度與腺體損害程度以及淋巴細(xì)胞浸潤灶等級(jí)分?jǐn)?shù)呈直接相關(guān)性，IL?17A mRNA越高，損傷越嚴(yán)重［10］。其可能的機(jī)制為IL?17A通過核因子-κB（nuclear factor?κB，NF?κB）信號(hào)通路，損害腺體組織細(xì)胞緊密鏈接屏障的完整性，導(dǎo)致外分泌腺功能缺失［11］。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明通過抑制IL?17、IFN?γ可有效改善淋巴細(xì)胞浸潤等異常病理變化以及外分泌腺分泌情況［9］。

艾拉莫德是國家食品藥品監(jiān)督管理局臨床批準(zhǔn)的Ⅰ類新藥，于2011年8月獲得我國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于治療成人活動(dòng)性RA。其化學(xué)名為 N?［3?（甲酞胺基）?4?氧?6?苯氧基?4H?1?苯并毗喃?7?基］甲烷磺酰胺［12］。艾拉莫德不僅能選擇性抑制環(huán)氧化酶-2（COX?2），還能抑制IFN?γ，IL?1、IL?6、TNF?a、IL?17 等細(xì)胞因子及免疫球蛋白（IgM、IgG）的產(chǎn)生，顯著降低炎癥反應(yīng)［13］。目前國內(nèi)外有大量艾拉莫德治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究，其抑制的相關(guān)炎癥通路與干燥綜合征發(fā)病機(jī)制過程中炎性機(jī)制有相似性［14-15］，故理論上艾拉莫德可用于干燥綜合征治療，且目前艾拉莫德試用于治療干燥綜合征收到了確切療效［3］。但具體治療機(jī)制以及療效情況有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過艾拉莫德對(duì)干燥綜合征模型小鼠干預(yù)后相關(guān)指標(biāo)改變的相關(guān)研究，從多發(fā)面探究艾拉莫德對(duì)干燥綜合征是否有治療效果以及可能的治療靶點(diǎn)，為尋求安全有效的新型治療藥物提供依據(jù)。艾拉莫德為水難溶性藥物，而羧甲基纖維素鈉借助羧甲基纖維的增黏性及少量電荷而形成一種空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，起到了很好的助懸作用。將艾拉莫德加入到混懸介質(zhì)5%羧甲基纖維素鈉溶液中混合均勻制成混懸劑，保證了藥物的均勻分布，可以增加其口服后在胃腸道分布面積，使吸收徹底，提高生物利用度。根據(jù)流變學(xué)及沉降體積比等參數(shù)，可知該制劑的穩(wěn)定性良好。

非肥胖型糖尿?。∟OD）小鼠屬于自發(fā)胰島素依賴型糖尿病傾向的小鼠，它同時(shí)也是理想的自發(fā)性干燥綜合征小鼠模型。它早期就會(huì)出現(xiàn)口干、飲水量增加的臨床表現(xiàn)，以及血清中自身抗體滴度的升高，病理檢測發(fā)現(xiàn)NOD小鼠外分泌腺體中存在淋巴細(xì)胞浸潤，隨著年齡增長，浸潤度也逐漸變大［16］。呈現(xiàn)出與干燥綜合征患者相似的免疫調(diào)節(jié)紊亂，病理學(xué)改變及臨床表現(xiàn)，并有明顯血清學(xué)抗體水平顯著升高。頜下腺呈現(xiàn)組織破壞并伴有以Th17細(xì)胞為主的大量淋巴細(xì)胞浸潤，且外周血有大量炎性因子分泌水平升高，包括IL?17及IFN?γ。其大量淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺大約于12～16周齡時(shí)，且在雌性小鼠中發(fā)生率達(dá)60%～80%［17］。所以它被認(rèn)為比較適合研究SS的動(dòng)物模型。而C57BL/6為非易發(fā)病小鼠，必須經(jīng)頜下腺勻漿或蛋白提純物等實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)后可建立干燥綜合征模型小鼠［9］，故C57BL/6小鼠可作為正常對(duì)照組。

該實(shí)驗(yàn)中，予目前較成熟的干燥綜合征動(dòng)物模型鼠（NOD小鼠）為研究對(duì)象，并以非易感干燥綜合征小鼠C57BL/6為正常對(duì)照組，予不同濃度艾拉莫德灌胃治療，檢測小鼠的飲水量、進(jìn)食量、體重指標(biāo)變化情況。并于6周后，對(duì)各組小鼠的頜下腺組織進(jìn)行HE染色病理觀察淋巴細(xì)胞浸潤情況及病理分級(jí)評(píng)價(jià)，血清檢測以IL?17、IFN?γ為代表的炎性因子的變化情況，了解艾拉莫德對(duì)干燥綜合征炎性反應(yīng)及外分泌腺功能影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，艾拉莫德能有效改善小鼠的外分泌功能，予艾拉莫德治療小鼠的外分泌腺體中淋巴細(xì)胞浸潤灶明顯減輕，并減輕炎性因子的產(chǎn)生，特別是IL?17，因此具有保護(hù)腺泡組織結(jié)構(gòu)的完整性及分泌功能。且艾拉莫德2組較低艾拉莫德1組效果更顯著，這為臨床應(yīng)用艾拉莫德治療干燥綜合征提供必要的理論依據(jù)。該實(shí)驗(yàn)中，檢測各組小鼠血清IFN?γ并未出現(xiàn)明顯的改善，模型組與空白組也未出現(xiàn)明顯差異，考慮IFN?γ在干燥綜合征模型小鼠外周血中出現(xiàn)較IL?17晚，且培養(yǎng)小鼠周齡較小，炎癥反應(yīng)并未達(dá)到理想程度?？稍诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)周期，并監(jiān)測不同周齡的炎性因子指標(biāo)變化，外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤情況，以及艾拉莫德干預(yù)影響。同時(shí)此次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步設(shè)置較高劑量組（50 mg/kg）甚至高劑量組（90 mg/kg），從而進(jìn)一步探究其療效是否具有劑量依賴性關(guān)系，同時(shí)可探究其高劑量毒性及半數(shù)致死量情況。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了艾拉莫德可抑制干燥綜合征模型小鼠（NOD小鼠）外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤情況，減輕模型鼠血清中炎性因子生成，保護(hù)腺泡組織結(jié)構(gòu)的完整性及分泌功能，明顯改善小鼠的外分泌腺分泌功能及生存質(zhì)量。說明艾拉莫德具有抗干燥綜合征模型小鼠外分泌腺炎癥作用，為臨床應(yīng)用艾拉莫德治療干燥綜合征提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。