何錦園 陳雪霞 胡柳 黃邵洪

1中山大學附屬第三醫(yī)院心胸外科（廣州 510630）；2中山大學附屬第一醫(yī)院東院護理部（廣州 510630）；3中山大學附屬第七醫(yī)院心胸血管外科（廣東深圳 518107）

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是最常見的死因之一［1］。肺癌的病因復雜，經(jīng)多學科綜合治療近年來五年生存率有所提升，但總體而言預后不良［2］。因此研發(fā)新的治療方法有積極意義。

腫瘤免疫耐受是指腫瘤通過某些機制逃過機體的免疫系統(tǒng)監(jiān)視，生長不受機體控制［3］。腫瘤免疫耐受的機制尚未完全清楚［4］，腫瘤免疫耐受細胞的產(chǎn)生是其機制之一［5］。免疫耐受細胞數(shù)眾多，可產(chǎn)生白介素（IL）?10，轉化因子（TGF）?beta等在內的免疫耐受分子［6］。產(chǎn)生IL?10的B淋巴細胞被稱為B10細胞［7］，是免疫耐受細胞家族一員，在腫瘤免疫耐受起重要作用［8］。通過產(chǎn)生IL?10，B10細胞能夠抑制免疫效應細胞活性，降低機體抗腫瘤能力［9］。有報道顯示，腫瘤患者體內免疫耐受細胞數(shù)量增加［10］，但具體成因目前尚不清楚。

最新研究［11］表明micro RNA（miR）能夠調節(jié)某些細胞因子表達。miR是長度為18-22個核苷酸的單鏈RNA，在轉錄后階段能調節(jié)靶基因的表達。LIU等［12］報道m(xù)iR?98能夠抑制巨噬細胞IL?10的表達。外源性miR?98能否調節(jié)腫瘤個體B淋巴細胞白介素的表達目前尚無研究。由此，筆者推測miR?98表達障礙導致了肺癌患者B10細胞IL?10升高。本研究旨在驗證miR?98通過抑制肺癌患者B10細胞IL?10的表達而抑制腫瘤生長。

1 材料與方法

1.1研究對象收集中山大學附屬第三醫(yī)院2016年2月至2016年4月首診為非小細胞肺癌（由外科醫(yī)師和病理科醫(yī)師共同確診）的患者外周血標本共10例，其中男5例，女5例，平均年齡55.4歲，有吸煙史患者3例，以氣胸患者外周血標本10例作為對照組。本研究對象的排除標準為：（1）肺癌復發(fā)，（2）使用免疫抑制劑，（3）伴有自身免疫性疾病或其他器官嚴重疾病。研究設計和過程經(jīng)過中山大學臨床倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1血樣采集與單核細胞的分離外周血樣由上肢靜脈采集，每位受試者30 mL。外周血單核細胞（PBMC）通過梯度密度離心法分離。

1.2.2B淋巴細胞分離與培養(yǎng)CD19B淋巴細胞通過免疫磁珠分離獲得，按試劑盒（Mitenyi Bio?tech）使用手冊操作。B淋巴細胞純度通過流式細胞儀檢測，超過98%為合格，培養(yǎng)基為RPMI1640，加入10%小牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺及 20 ng/mL anti?CD40抗體，2～3 d換1次液。細胞活性通過臺盼藍試驗評估，超過98%者可用于實驗。

1.2.3外周血B10細胞頻率測定將分離獲得的PBMC用FITC標記的anti?CD19單抗或同型IgG（BD Bioscience）于4℃下染色30 min，PBS沖洗3遍，1%多聚甲醛固定30 min，0.5%皂素孵育10 min，APC標記的anti?IL?10 單抗（BD Bioscience）4℃下染色30 min，置于流式細胞儀（BD Bioscience）下分析。結果由Flowjo（TreeStar）軟件分析處理。同型IgG染色的細胞數(shù)據(jù)作為基線參考。

1.2.4實時定量PCR檢測B淋巴細胞miR?98和IL?10 mRNA用TRIzol試劑盒（Invitrogen）提取總RNA，制備獲得DNA第一單鏈，加入SYBR Green Master Mix，miR?98和IL?10引物分別為gttctttgggg?agccaacag和gctccctggtttctcttcct（由中國深圳Enke Biotech公司設計），置于實時定量PCR儀（Bio rad）擴增，結果用2-△△Ct法計算，表示為對照組倍數(shù)。

1.2.5miR?98脂質體制備分別取膽固醇、1，2-二油?；蚜姿徕c和磷脂酰膽堿各100 mg溶于氯仿4.5 mL中，氯仿蒸發(fā)后獲得脂質薄膜，抽取10 mg脂質薄膜加入0.5 mg miR?98質粒（Enke Bio?tech，Shenzhen，China）或0.5 mL生理鹽水（對照），混勻10 min，加熱至60℃并震蕩15 min，蒸餾水反復沖洗備用［13］。

1.2.6B淋巴細胞miR?98的高表達測定將miR?98脂質體（10 μg/mL）加入對照組外周血提純的B淋巴細胞培養(yǎng)液中，24 h后收取細胞用以后續(xù)試驗，經(jīng)qRT?PCR檢測，miR?98在B淋巴細胞中表達增高約5倍。

1.2.7miR?98脂質體對B淋巴細胞IL?10表達的抑制效果由對照組外周血中提取B淋巴細胞，miR?98高表達和野生型B淋巴細胞均加入1 μg/mL LPS刺激48 h，qRT?PCR檢測IL?10表達。

1.2.8肺癌小鼠模型的建立肺癌小鼠模型由6～8周齡SPF級別、體重約18～20 g的雄性BALB/c小鼠建立（購自廣東醫(yī)學實驗動物中心，許可證號為SYXK（粵）2016?0122），飼養(yǎng)溫度為21℃ ±2℃，相對適度為30%～70%。肺癌細胞株KLN205（ATCC）在 Dulbecco′s Modified Eagle Medium 中培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液，細胞活性通過臺盼藍試驗評估，超過99%者用于進一步試驗。每只小鼠背部皮下注射10E6肺癌細胞，每日測量記錄一次瘤體大小。實驗用小鼠通過中山大學動物中心認證，過程遵循相關規(guī)定。

1.2.9miR?98脂質體抑制瘤體生長的觀察在試驗第0、4和8天，荷瘤小鼠通過腹腔內注射miR?98脂質體（0.2 mg/只）或對照脂質體，每日測量記錄一次瘤體大小。

1.3統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)的正態(tài)分布用微軟公司Excel Norm.DIST驗證。定量資料兩組間差異用t檢驗，多組別間差異用單因素方差分析ANOVA法，兩組間相關分析用微軟公司Excel進行，P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1肺癌患者外周血B10細胞增高經(jīng)流式細胞術檢測，實驗組10例肺癌患者外周血B10細胞數(shù)顯著高于健康對照組（14.2%vs.2.74%，P＜0.000 1，圖1），實驗結果證實肺癌患者B10細胞增加。

2.2肺癌患者外周血B淋巴細胞miR?98表達降低從PBMC中提取CD19B淋巴細胞（圖2A），qRT?PCR檢測結果顯示肺癌患者外周血B淋巴細胞miR?98表達僅為對照組的0.19倍，而健康受試者為對照組0.44倍（圖2B）。經(jīng)檢測B10細胞IL?10表達水平，結果顯示肺癌患者較健康受試者顯著升高（1.55 vs.0.21，P ＜0.000 1，圖2C）。B淋巴細胞miR?98與IL?10相關分析顯示，二者呈負相關（r=-0.779 3，P ＜0.000 1）（圖2D）。這些結果提示，miR?98可能是B淋巴細胞IL?10的抑制因子，而肺癌患者B淋巴細胞miR?98減少可能造成IL?10表達增加。

2.3miR?98高表達抑制B淋巴細胞IL?10為闡明miR?98在B淋巴細胞IL?10表達中的調節(jié)作用，通過轉染miR?98質粒獲得高miR?98表達的B淋巴細胞，轉染使B淋巴細胞miR?98表達升高了6倍（圖3A）。miR?98高表達和野生型B淋巴細胞經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生IL?10。經(jīng)qRT?PCR檢測，野生型B淋巴細胞IL?10表達增加，為對照組1.46倍，而miR?98高表達的B淋巴細胞僅為0.16倍（圖3B）。結果證實，B淋巴細胞miR?98對IL?10表達有抑制作用。

圖1 流式細胞術-肺癌患者外周血B10細胞數(shù)增高Fig.1 Peripheral B10 cells are more in patients with lung cancer

圖2 miR?98和IL?10 mRNA在外周血中的評估Fig.2 Assessment of miR?98 and IL?10 mRNA in peripheral B cells

2.4 miR?98脂質體抑制荷瘤小鼠肺癌生長荷瘤小鼠模型接受3次間隔3 d的miR?98脂質體腹腔內注射，之后12 d每天測量記錄一次瘤體大小，結果顯示應用miR?98脂質體顯著抑制瘤體生長（圖4A）。12 d后處死小鼠，采集外周血檢測B10細胞數(shù)量，結果顯示注射生理鹽水荷瘤小鼠B10細胞數(shù)量顯著高于對照小鼠，給予miR?98脂質體荷瘤小鼠B10細胞數(shù)量顯著降低（圖4B?C）。結果證實：應用miR?98脂質體抑制荷瘤小鼠B淋巴細胞IL?10表達，進而抑制肺癌生長。

3 討論

圖3 MiR?98抑制B 淋巴細胞IL?10的表達Fig.3 MiR?98 inhibits IL?10 expression in B cells

圖4 MiR?98脂質體抑制B10細胞和腫瘤生長Fig.4 MiR?98?carrying liposomes inhibit B10 cells and suppress tumor growth

B10細胞在腫瘤免疫耐受中有重要作用，協(xié)助癌細胞逃避機體免疫監(jiān)視［9］。最新研究顯示，肺癌患者B10細胞較健康人群高，而外周血B淋巴細胞miR?98降低，IL?10增高，二者呈負相關，這提示miR?98能抑制B淋巴細胞IL?10表達。本研究同樣證實了上述觀點，荷瘤小鼠注射miR?98脂質體顯著抑制瘤體生長并減少外周血B淋巴細胞數(shù)量，雖然miR?98未能完全清除腫瘤，但顯著抑制了瘤體生長，這使其有望成為肺癌治療的一個新手段。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血B10細胞較健康受試者顯著升高。產(chǎn)生IL?10的T和B細胞有免疫調節(jié)功能，例如Ⅰ型免疫調節(jié)T細胞和B10細胞［14-15］。在適當?shù)拇碳ひ蜃幼饔孟拢庖哒{節(jié)T或B淋巴細胞釋放IL?10抑制其他細胞免疫功能，進而抑制免疫反應［16］。一方面這可能對機體有利，比如抑制炎癥［16］，另一方面，對于癌癥患者則是有害的，因為免疫調節(jié)細胞會抑制腫瘤特異性免疫，比如抑制腫瘤特異性CD8+T細胞［17-18］。

闡明腫瘤患者B淋巴細胞IL?10高表達的機制有重要意義。文獻［12］報道，miR?98能抑制巨噬細胞IL?10表達，肺癌患者B10細胞升高這一現(xiàn)象提示miR?98在B淋巴細胞的表達可能存在異常。這一推論得到實驗數(shù)據(jù)支持：肺癌患者B淋巴細胞miR?98表達較健康人顯著降低。有研究指出，IL?10基因3′UTR處有miR?98結合位點，miR?98能與之結合從而抑制IL?10表達［12］。以脂質體作為載體，我們構建了攜帶miR?98的脂質體，用miR?98脂質體處理荷瘤小鼠后，瘤體體積和外周血B10細胞數(shù)較生理鹽水對照組均顯著減少。

總之，本研究結果表明，肺癌患者外周血B淋巴細胞miR?98低表達而IL?10高表達；增加miR?98表達抑制B淋巴細胞IL?10表達，這為miR?98脂質體作為肺癌潛在的治療手段提供了重要的理論依據(jù)，這是價值所在。但本研究也存在一定的不足，本研究只在基因水平驗證了miR?98與IL?10的負相關的關系，未從蛋白水平進一步驗證。由于受人體倫理影響，標本例數(shù)偏少，下一步研究尚需加大樣本量。