常玉梅，黃晶，孫博，蘇寶鋒，梁利群

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,中國水產(chǎn)科學(xué)研究院特殊生境魚類種質(zhì)特性與抗逆育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

七鰓鰻（Lamprey）是現(xiàn)存的古老無頜類脊椎動(dòng)物的代表種，是脊椎動(dòng)物演化發(fā)育生物學(xué)研究的重要模式動(dòng)物。全球有3科（七鰓鰻科Petromyzonidae、地蝗科Geotriidae和水螨科Mordaciidae），10屬，超過40種。其中4種隸屬于南半球的地蝗科和水螨科，而其余種都屬于北半球的七鰓鰻科[1,2]。

七鰓鰻屬Lethenteron隸屬于七鰓鰻科，主要分布在歐亞大陸[3]?；谛螒B(tài)特征和分子數(shù)據(jù)，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該屬至少有6個(gè)有效種：包括一個(gè)洄游寄生種北極七鰓鰻（Lethenteron camtschaticum,以前為Lampetra japonica）、兩個(gè)淡水非寄生種溪七鰓鰻（Le.kessleri，以前為 Lampetra japonica kessleri和 Le.reissneri,以前為 Lampetra reissneri）[4,5]、兩個(gè)日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)的隱秘種Lethenteron sp.N和Lethenteron sp.S[6]，以及一個(gè)朝鮮七鰓鰻（Le.morii，以前為 Lampetra morii&Eudontomyzon morii）[2,7]。但近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)淡水溪七鰓鰻在表型、核DNA及mtDNA高度相似，將二者歸為同一種Le.reissneri complex[6,8]。最新研究表明，這兩個(gè)淡水溪七鰓鰻與北極七鰓鰻又無明顯的種間差異，將其視為北極七鰓鰻的兩種生態(tài)類型[8,9]。因此看出，七鰓鰻屬雖被認(rèn)定為一個(gè)有效屬，但是其種類的歸屬仍存在分歧。

線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（cytochrome coxidase subunit I,COI）在種間的遺傳變異顯著大于種內(nèi)的遺傳變異，即使兩個(gè)親緣關(guān)系非常相近的物種，COI基因的差異也會超過2%[10,11]，是物種鑒定的有效基因。如筆者利用COI基因分析了綏芬河珠星三塊魚（southern forms ofTribolodon hakonensis）和日本珠星三塊魚（northern forms of Tribolodon hakonensis）的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者之間遺傳距離大于2%，表明這兩個(gè)群體已出現(xiàn)明顯分化，不能視為同一種[12]。

本研究通過分析七鰓鰻屬種屬分類存有爭議的3個(gè)種，北極七鰓鰻、溪七鰓鰻及朝鮮七鰓鰻的COI基因，以明確這3個(gè)種的分類地位，為更好地保護(hù)和利用這些優(yōu)良的種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共用到102尾樣本，各樣本的采集國別、地點(diǎn)、GenBank登錄號及出處見表1。樣品來源如下：（1）本研究在黑龍江撫遠(yuǎn)采集北極七鰓鰻46尾鰭條于95%乙醇中保存；（2）從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中下載來自俄羅斯26個(gè)采樣點(diǎn)（包括黑龍江、薩哈林島、國后島、堪察加半島、北冰洋、西伯利亞南部、烏特霍洛克河和克拉維耶姆河）及美國阿拉斯加育空河的北極七鰓鰻COI序列36條；（3）從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中下載來自俄羅斯烏特霍洛克河、克拉維耶姆河和米斯蒙特河的溪七鰓鰻Le.reissneri complex COI序列 17 條；（4）從 NCBI Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中下載來自中國遼寧丹東和黑龍江撫遠(yuǎn)的朝鮮七鰓鰻線粒體全基因組序列3條。

1.2 基因組DNA的提取

剪取少量95%乙醇保存的鰭條，濾紙吸干乙醇，放入2mL離心管中加入600μLDNA裂解液（成分：1mol/LTrispH8.0、5MNaCl、0.5mol/LEDTApH8.0、10%SDS和200μg/mL蛋白酶K）于55℃過夜消化，次日加入等體積的酚/氯仿混合液（1∶1）抽提1次，12 000r/min室溫離心10min，吸取上清（～550μL）加入1mL無水乙醇沉淀，12 000r/min室溫離心10min，70%乙醇洗滌1次，室溫干燥10min，加入0.1×TE溶解。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，Nanodrop 8000（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）測定 DNA 濃度，稀釋至 10ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 3種七鰓鰻樣本來源信息Tab.1 Samples information of three lamprey species

1.3 COI基因的引物來源及PCR擴(kuò)增

線粒體COI引物參照Prasanna等[16]報(bào)道的通用引物（COI-F：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTG GCAC-3′；COI-R：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAA GAATCA-3′）。PCR 反應(yīng)總體積體系為 25μL，其中包含自制 PCR buffer mix18μL（包括 50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl、0.10%Triton X-100、1.5mmol/L MgCl2、0.10%NP-40、0.01%明膠、200μmol/L 4 種 dNTP），濃度10μmol/L的上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶 0.2μL（Fermentas，5U/L），模板 DNA 2μL，去離子滅菌水補(bǔ)至總體積25μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性 3min，35 個(gè)循環(huán)包括 95℃15s、57.7℃30s、72℃30s，最后72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至北京諾賽基因公司進(jìn)行測序。

1.4 序列處理及分析

將測序得到的序列文件用DNASTAR.Lasergene 7.1中的EditSeq模塊轉(zhuǎn)換成fasta格式用于后續(xù)分析。采用ClustalX1.83對COI基因序列進(jìn)行多重比對，獲得對齊后的同源序列,采用NCBI網(wǎng)站提供的Bankit提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中。利用DNAsp 5.10.01鑒定單倍型；使用MEGA7.0計(jì)算所得單倍型的堿基組成、單倍型間的替換率和轉(zhuǎn)換/顛換R值。將從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的56條已知COI序列和mtDNA全基因組序列（北極七鰓鰻36條、溪七鰓鰻17條和朝鮮七鰓鰻3條）與本研究得到的46條序列合并后采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建基于Kimura雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter,K2P）的單倍型進(jìn)化樹，并經(jīng)1 000次自展檢驗(yàn)（Bootstrap），選用黃鱔 Monopterus albus COI基因相應(yīng)片段（GenBank登錄號：MF122533）作為系統(tǒng)進(jìn)化分析的外類群；用MEGA7.0計(jì)算基于K2P模型下各個(gè)類群內(nèi)部的遺傳距離及各類群間的平均遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 單倍型分析

序列經(jīng)比對處理后得到COI有效序列長度為451bp。102條有效序列共檢測到16種單倍型（圖1）。北極七鰓鰻共檢測到14種單倍型，其中中國群體有4種單倍型（GenBank登錄號：MH638349～MH638352），俄羅斯群體多樣性較高，有11種單倍型，美國群體有3種單倍型，大部分個(gè)體共享2種單倍型Hap1和Hap5；溪七鰓鰻有3種單倍型，均與北極七鰓鰻共享；朝鮮七鰓鰻獨(dú)享2種單倍型，分布在兩個(gè)不同的地理群體（遼寧丹東和黑龍江撫遠(yuǎn)）（表2）。單倍型堿基組成分析顯示，A、T、C、G 4種堿基所占比例恒定，平均含量分別為27.7%、30.3%、28%和14%，A+T含量（58%）明顯高于C+G含量（42%）。平均堿基替換率為19.03，堿基交換/顛換R值為3.19。

2.2 單倍型序列分歧度分析

圖1 COI基因在3種七鰓鰻群體中的16種單倍型Fig.1 Sixteen haplotypes of COI gene found in three lamprey species

表2 COI基因的16種單倍型在3種七鰓鰻群體中的分布Tab.2 Distribution of 16 haplotypes of COI gene in threelamprey species

16種單倍型間的序列分歧度計(jì)算結(jié)果見表3。由表3可知，北極七鰓鰻14種單倍型間的序列分歧度為0.002～0.011，其中中國群體4種單倍型間的序列分歧度只有0.002～0.004，俄羅斯群體11種單倍型間的分歧度為0.002～0.011，美國群體3種單倍型分歧度為0.002～0.007；溪七鰓鰻和北極七鰓鰻共享3種單倍型，序列分歧也只有0.002～0.004；朝鮮七鰓鰻獨(dú)享2種單倍型，Hap9和Hap16，序列分歧度達(dá)到0.020。遼寧丹東群體單倍型Hap9與北極七鰓鰻和溪七鰓鰻的單倍型序列分歧只有0.002～0.011，而黑龍江撫遠(yuǎn)群體單倍型Hap16與北極和溪七鰓鰻的單倍型序列分歧較大，為0.016～0.025。

2.3 3種七鰓鰻的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

采用MEGA7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建3種七鰓鰻16種單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。由圖2可知，除了朝鮮七鰓鰻黑龍江群體Hap16單獨(dú)聚類外，其余15種單倍型無明顯分化，聚為一支。各類群間和類群內(nèi)平均遺傳距離顯示，北極七鰓鰻和溪七鰓鰻親緣關(guān)系較近，而朝鮮七鰓鰻與二者較遠(yuǎn)；北極和溪七鰓鰻種內(nèi)不同群體無明顯分化，而朝鮮七鰓鰻不同群體存在一定分化（表4）。

圖2 七鰓鰻屬魚類COI基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化NJ樹Fig.2 Neighbour-Joining tree of COI gene in genus Lethenteron

表3 16種單倍型間的序列分歧度Tab.3 Sequence divergenceamong 16 haplotypes

表4 3種七鰓鰻各類群間和各類群內(nèi)平均遺傳距離Tab.4 Mean genetic distance between and within each group in three lamprey species

3 討論

3.1 北極七鰓鰻和溪七鰓鰻的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

北極七鰓鰻主要分布在歐亞大陸的東部、日本列島，朝鮮半島的北部及北美大陸的西北部，有溯河寄生型（anadromous-parasitic form）和河流非寄生型（fluvial-nonparasitic form，也叫定居型）兩種生活史類型[17-19]。然而，一些學(xué)者認(rèn)為這兩種生活史類型的命名和分類也有問題。Yamazaki等[19]利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究了溯河寄生型、河流定居型和陸封型北極七鰓鰻的群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些同水域的七鰓鰻能夠一起產(chǎn)卵，而且存在緊密的基因流，推測這種大小不匹配的交配和不同生活史的可塑性是導(dǎo)致不同類型群體基因流產(chǎn)生的重要原因[20]；隨后Artamonova等[8]利用COI基因分析俄羅斯北極七鰓鰻洄游型和定居型群體發(fā)現(xiàn)，二者具有相同的單倍型，認(rèn)為不同的生活史類型是由北極七鰓鰻表型的可塑性進(jìn)化而來。

溪七鰓鰻分布也很廣泛，從歐亞東部河流到日本北部，包括阿納德爾、堪察加半島、鄂霍次克海、黑龍江、薩哈林島和日本北部[6,17]。早期學(xué)者根據(jù)地理分布和生活史，認(rèn)為溪七鰓鰻Le.kessleri和Le.reissneri是兩個(gè)獨(dú)立種[2]。而 Makhrov等[18]分析了來自俄羅斯北部70個(gè)河流七鰓鰻的形態(tài)、分布、生態(tài)、資源量等認(rèn)為棲息在歐亞大陸北方的七鰓鰻?wèi)?yīng)為北極七鰓鰻的不同生態(tài)類型；隨后Artamonova等[9]分析了歐亞大陸七鰓鰻屬COI部分序列單倍型的分布，同樣認(rèn)為地理分布和生活史均不能成為鑒定這些種類的標(biāo)準(zhǔn)，支持將Le.kessleri和Le.reissneri劃分為北極七鰓鰻的兩種生態(tài)型而非兩個(gè)獨(dú)立種。

分子聚類研究發(fā)現(xiàn)，北極七鰓鰻和溪七鰓鰻組成一個(gè)單獨(dú)的分支，沒有種間差異[6,8]。從本研究的系統(tǒng)聚類也可以看出，來自中國、俄羅斯和美國不同水域的北極七鰓鰻，雖然有14種單倍型，多樣性較高，但種內(nèi)遺傳距離只有0.002，14種單倍型聚為一支（圖2）。而溪七鰓鰻的3種單倍型均為北極七鰓鰻的主效單倍型（Hap1，Hap5和Hap13），種間遺傳距離最小，只有0.001（表4）。由此推測，溪七鰓鰻起源于北極七鰓鰻，支持二者為同一種的不同生態(tài)類型，這與日本和俄羅斯學(xué)者的觀點(diǎn)一致。

3.2 朝鮮七鰓鰻的分類地位

朝鮮七鰓鰻主要分布在朝鮮半島的中部和北部河流，我國遼寧和黑龍江也有少量分布[14,15,17]。早期命名為Lampetra morii，后來根據(jù)形態(tài)特征建議為Eudontomyzon morii[7]，目前根據(jù)分子數(shù)據(jù)歸為Lethenteron屬[2,17]。Goto[21]利用 COI基因重建了東亞地區(qū)七鰓鰻屬的系統(tǒng)進(jìn)化樹，同樣支持朝鮮七鰓鰻是七鰓鰻屬的一個(gè)有效種。本研究結(jié)果表明，雖然我國遼寧丹東和黑龍江撫遠(yuǎn)地區(qū)的朝鮮七鰓鰻獨(dú)享兩種單倍型，但是只有黑龍江撫遠(yuǎn)群體獨(dú)享的Hap16與北極七鰓鰻的14種單倍型分歧較大，從0.016～0.025不等，平均0.02，達(dá)到不同種的分化水平（～2%），認(rèn)為朝鮮七鰓鰻黑龍江群體為七鰓鰻屬的一個(gè)有效種。而遼寧丹東群體獨(dú)享的Hap9與北極七鰓鰻序列分歧較低0.002～0.011，且與黑龍江群體單倍型分歧達(dá)到種級分化水平。因此，這種差異是否采樣誤差導(dǎo)致，需待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究分析的七鰓鰻屬的3個(gè)種，實(shí)際只有兩個(gè)有效種，北極七鰓鰻和朝鮮七鰓鰻。其中北極七鰓鰻由于生活環(huán)境、大小及表型特征的多樣性存在多種生態(tài)類型。