邱振魯，吳楊藝璇，孫楨，于學(xué)文，莊杰隆

(齊魯理工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200)

鹽地堿蓬(Suaedasalsa)，藜科堿蓬屬植物[1]，一年生草本，多分布在黃河三角洲海濱及荒漠低處的鹽堿地上[2]，為遼寧、山東、江蘇一帶平原海岸淤灘上的優(yōu)勢物種[3]。研究表明，種植鹽地堿蓬能大大降低土壤的含鹽量[4]，并且作為鹽堿地指示生物，對其進(jìn)行研究有助于促進(jìn)植物耐堿脅迫機理和應(yīng)用的研究發(fā)展[5]。

近年來，重金屬污染日益嚴(yán)重，很多鹽堿地已經(jīng)不是單純的鹽堿污染，而是鹽堿和多種重金屬的復(fù)合污染，所以，研究重金屬對植物生長發(fā)育的影響十分必要。重金屬通過礦采、化工、化石燃料的燃燒、各類污水的排放、農(nóng)藥以及化肥的施用、大氣沉降等途徑持續(xù)地進(jìn)入生物圈，在環(huán)境中具有潛在危害，極易被生物富集，并在土壤中累積，對種子的萌發(fā)過程產(chǎn)生不良影響[6]。目前關(guān)于鹽地堿蓬種子萌發(fā)的研究，僅限于鹽堿脅迫下種子萌發(fā)指標(biāo)與幼苗生長指標(biāo)的研究[7]，以及鹽堿與營養(yǎng)元素互作對上述指標(biāo)影響的研究[8]和外源性物質(zhì)浸種對鹽脅迫下鹽地堿蓬種子萌發(fā)指標(biāo)的影響[9]。重金屬脅迫對鹽地堿蓬種子發(fā)芽各指標(biāo)的影響未見文獻(xiàn)報道。本論文研究了不同濃度Zn2+、Pb2+、Cd2+脅迫對鹽地堿蓬種子萌發(fā)的影響，以期為鹽地堿蓬在重金屬污染環(huán)境下的種植以及鹽生植物資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽地堿蓬種子(上海源葉生物科技有限公司提供)，Pb(NO3)2、ZnSO4、CdCl2均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 種子的選取與預(yù)處理

鹽地堿蓬種子具有二型性，本實驗采用的是黑色的籽粒。用鑷子挑選大小相近、無破損、發(fā)黑發(fā)亮的種子，用2% NaClO浸泡30 min，除去種子表面的雜菌。再用蒸餾水反復(fù)沖洗，洗凈殘留在表面的NaClO，風(fēng)干備用。

1.2.2 處理設(shè)計

分別配置濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、3.2 g·L-1的ZnSO4工作液[10]，0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.2 g·L-1的Pb(NO3)2工作液[11]和0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·L-1的CdCl2工作液[12]。

向經(jīng)高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)皿中放入濾紙，分別加入上述不同濃度和種類的工作液，排出濾紙內(nèi)氣泡并均勻放入處理好的種子50粒，蓋好培養(yǎng)皿，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]。每組處理做3個重復(fù)。

1.2.3 指標(biāo)測定

測定指標(biāo)包括發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、根長和芽長及根系活力[14-15]。以胚根突破種皮1 mm視為發(fā)芽，發(fā)芽指數(shù)計算到14 d。發(fā)芽14 d時，測定根長和芽長，以種子開始變色且翹起的位置至最長葉葉尖的長度為芽長，剩余的位置至最長根根尖的長度為根長，每皿選取長度接近的10株進(jìn)行測量，取平均值[16]。

根系活力測定采用TTC還原法，制作TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線，以空白實驗樣品液為參比，在485 nm波長下測定剪取的根尖樣品處理液的吸光度，根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即求出TTC還原量，按照以下公式即可求出根系活力[17]：

TTC還原強度(mg·g-1·h-1)=m/(m0·t)

式中：m為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的TTC還原量(mg)；m0為根尖樣品質(zhì)量(g)；t為反應(yīng)時間(h)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對鹽地堿蓬發(fā)芽率及發(fā)芽勢的影響

2.1.1 Pb2+

不同濃度Pb2+對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響如圖1所示，不同濃度處理組之間發(fā)芽勢差異均顯著，其中，Pb2+濃度為0.05和0.10 g·L-1時，發(fā)芽勢與對照組相比差異極顯著，可知0.05 g·L-1Pb(NO3)2脅迫就可以對鹽地堿蓬的發(fā)芽勢產(chǎn)生抑制作用。將其處理分為低濃度組(0.05、0.1 g·L-1)、中濃度組(0.2、0.3、0.5 g·L-1)和高濃度組(0.8、1.2 g·L-1)，數(shù)據(jù)分析表明，組間差異極顯著，組內(nèi)差異顯著。不同濃度處理組之間的發(fā)芽率差異顯著性分析結(jié)果表明，與對照相比，低濃度組內(nèi)Pb2+對發(fā)芽率影響顯著，中濃度組內(nèi)及高濃度組內(nèi)差異不顯著，但組間差異顯著。

圖1 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對鹽地堿蓬發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

不同濃度Pb2+脅迫下，發(fā)芽勢的波動幅度大于發(fā)芽率的波動幅度，說明Pb2+對發(fā)芽勢影響更大，即對種子萌發(fā)前期的影響更為明顯。

2.1.2 Zn2+

從發(fā)芽勢來看，對照組與低濃度處理(0.1 g·L-1)和中等濃度處理組內(nèi)(0.2、0.4、0.6 g·L-1)差異不顯著，但組間差異極顯著。從發(fā)芽率來看，Zn2+濃度為0.1 g·L-1時，發(fā)芽率極顯著低于對照組；另外，在相鄰濃度的處理中，即0.2 g·L-1和0.4 g·L-1、0.6 g·L-1和0.8 g·L-1以及0.8 g·L-1和1.6 g·L-1之間，發(fā)芽率表現(xiàn)出極顯著差異，其他相鄰處理組之間差異均顯著，其中0.1 g·L-1和0.2 g·L-1處理組的發(fā)芽率差異不顯著。ZnSO4在低濃度下對發(fā)芽勢具有抑制作用，但中高濃度相比中低濃度呈上下波動狀態(tài)。隨ZnSO4濃度的升高發(fā)芽率呈降低趨勢。比較發(fā)芽勢和發(fā)芽率變化趨勢可知，低濃度Zn2+對發(fā)芽勢影響更加明顯，而高濃度Zn2+對發(fā)芽率影響更明顯。

2.1.3 Cd2+

0.05 g·L-1處理組與0.01 g·L-1處理組發(fā)芽勢差異顯著，而0.01 g·L-1處理組與對照組差異不顯著，說明CdCl2從0.05 g·L-1開始對鹽地堿蓬的發(fā)芽勢產(chǎn)生抑制作用。CdCl2超過0.05 g·L-1后，每個處理組都和相鄰低濃度處理組之間差異顯著，其中，0.2 g·L-1的處理組與0.3 g·L-1的處理組之間發(fā)芽勢差異極顯著。發(fā)芽率數(shù)據(jù)分析表明，CdCl2濃度為0.01 g·L-1時，發(fā)芽率極顯著低于對照組，表明從該濃度起，Cd2+就對發(fā)芽率產(chǎn)生了明顯的影響。從0.2 g·L-1到0.4 g·L-1，每個處理組的發(fā)芽率均與前一個處理組差異極顯著，其余處理組之間發(fā)芽率無顯著性差異。不同濃度Cd2+脅迫下：發(fā)芽勢整體呈波動下降趨勢，其中，0.05 g·L-1處理組與前一組比較，作用最為明顯；發(fā)芽率呈持續(xù)下降趨勢。

2.2 對發(fā)芽指數(shù)的影響

Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫下鹽地堿蓬發(fā)芽指數(shù)的變化趨勢如圖2所示，Pb(NO3)2脅迫下鹽地堿蓬種子發(fā)芽指數(shù)持續(xù)下降，說明隨著Pb(NO3)2濃度的升高，能使種子在失去發(fā)芽力之前持續(xù)劣變，種子活力持續(xù)下降；隨ZnSO4濃度的升高，發(fā)芽指數(shù)整體呈下降趨勢，在0.1～0.6 g·L-1時，下降趨勢更為明顯。隨著CdCl2濃度的升高，發(fā)芽指數(shù)也呈整體下降趨勢，在0.1～0.5 g·L-1時，下降趨勢最明顯。

圖2 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對鹽地堿蓬發(fā)芽指數(shù)的影響

2.3 對根長和芽長的影響

2.3.1 Pb2+

由圖3可知，從0.2 g·L-1開始，Pb2+對根長有顯著抑制作用；Pb2+濃度高于0.5 g·L-1時，根長顯著小于0.2 g·L-1的處理組。Pb2+濃度為0.05 g·L-1時，芽長顯著小于對照組，說明0.05 g·L-1的Pb2+就開始抑制鹽地堿蓬芽的生長；隨著Pb2+濃度的升高，中低濃度處理組芽長差異顯著，而高濃度組之間差異不顯著。Pb2+脅迫對根長和芽長的影響趨勢大致相同，均表現(xiàn)為隨濃度增加而下降，尤其是在中等濃度變化范圍內(nèi)，下降趨勢更為明顯。

圖3 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對鹽地堿蓬根長和芽長的影響

2.3.2 Zn2+

Zn2+濃度為0.2 g·L-1的處理組鹽地堿蓬根長顯著低于0.1 g·L-1和對照組，說明Zn2+濃度達(dá)到0.2 g·L-1時，開始對根尖細(xì)胞分裂產(chǎn)生明顯的抑制作用；Zn2+濃度高于0.8 g·L-1的處理組之間根長均無顯著差異。0.2 g·L-1處理組與0.6 g·L-1處理組之間差異顯著，且均與0.4 g·L-1處理組之間差異不顯著。隨脅迫Zn2+濃度的增加，鹽地堿蓬根長和芽長均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，根長的下降趨勢隨Zn2+濃度增加比較穩(wěn)定，而在較低的濃度下即可強烈抑制鹽地堿蓬芽的細(xì)胞分裂。

2.3.3 Cd2+

Cd2+脅迫下，鹽地堿蓬根長和芽長的變化趨勢一致，0.01 g·L-1處理組與對照組及0.05 g·L-1處理組之間差異顯著，說明低濃度Cd2+處理已經(jīng)對根尖和芽的細(xì)胞分裂產(chǎn)生了顯著的抑制作用；而Cd2+高于0.05 g·L-1的處理組之間根長、芽長差異不顯著，這可能是低濃度Cd2+的抑制效應(yīng)幾乎已經(jīng)達(dá)到極限，從而使高濃度抑制增強的作用不明顯。

2.4 對鹽地堿蓬根系活力的影響

2.4.1 Pb2+

鹽地堿蓬的根系活力隨Pb2+濃度的增加而呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，Pb2+濃度超過0.3 g·L-1時，根系活力下降趨勢更大，說明實驗中設(shè)置的高濃度處理組對根系中各種脫氫酶的抑制作用更加明顯(圖4)。

圖4 Pb2+、Zn2+、Cd2+脅迫對鹽地堿蓬根系活力的影響

2.4.2 Zn2+

與Pb2+脅迫的結(jié)果不同，低濃度Zn2+脅迫可以提高鹽地堿蓬根系活力，而高濃度Zn2+脅迫強烈抑制根系活力，推測這與鋅是植物生長的必要元素有關(guān)。研究表明，鋅是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活化劑，低濃度Zn2+脅迫能夠促進(jìn)根系活力，而高濃度Zn2+的抑制作用可能與重金屬引起胞內(nèi)蛋白變性或?qū)δ承└祷盍χ笜?biāo)中脫氫酶的抑制作用有關(guān)。

2.4.3 Cd2+

鹽地堿蓬的根系活力隨Cd2+濃度增加呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，Cd2+濃度為0.05～0.3 g·L-1時，隨濃度增加，根系還原酶活力下降最為明顯。

3 討論

Pb2+對鹽地堿蓬發(fā)芽率和發(fā)芽勢均呈現(xiàn)始終抑制的作用，Pb2+濃度為0.05 g·L-1時便與對照組產(chǎn)生了顯著差異，這說明Pb2+在較低的濃度下，可以抑制種子萌發(fā)時相關(guān)酶的活力或者使細(xì)胞內(nèi)蛋白或核酸變性。Zn2+對鹽地堿蓬發(fā)芽勢表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的結(jié)果，可能是Zn2+作為植物的必須元素，低濃度時能夠激活種子萌發(fā)時某些酶的活性，高濃度時導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白變性和對種子萌發(fā)過程中酶有非競爭性抑制作用。Zn2+對發(fā)芽率的影響沒有出現(xiàn)低濃度促進(jìn)的現(xiàn)象，猜測其原因可能是由于種子已經(jīng)在Zn2+脅迫處理14 d，其細(xì)胞內(nèi)的Zn2+積累較多。低濃度Cd2+脅迫即可以顯著抑制鹽地堿蓬發(fā)芽率和發(fā)芽勢，隨Cd2+濃度增大，鹽地堿蓬發(fā)芽率和發(fā)芽勢受抑制程度均增加，推測與重金屬導(dǎo)致核酸、蛋白變性或者抑制酶的活性有關(guān)。

Pb2+、Zn2+、Cd2+對鹽地堿蓬發(fā)芽指數(shù)的影響與對發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響幾乎一致，原因也可以認(rèn)為同上述分析。而對根長和芽長的影響，也與這3種重金屬對發(fā)芽率的影響幾乎一致。根的伸長是根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂和伸長區(qū)細(xì)胞伸長的結(jié)果，芽的增長是芽細(xì)胞分裂伸長的結(jié)果，重金屬進(jìn)入細(xì)胞，使核酸或蛋白變性，或者抑制有絲分裂過程中紡錘體的形成從而抑制細(xì)胞的分裂，或者通過抑制細(xì)胞骨架蛋白的形成影響細(xì)胞的伸長，可能是導(dǎo)致根長、芽長隨重金屬濃度增加而下降的原因。

除低濃度Zn2+對鹽地堿蓬根系活力有略微的促進(jìn)作用外，Pb2+、Cd2+均表現(xiàn)為隨濃度的升高對根系活力的抑制作用增強，Zn2+超過0.4 g·L-1后，開始對根系活力呈現(xiàn)抑制作用。低濃度Zn2+使根系活力增強的原因可能是因為其作為甘油醛-3-磷酸脫氫酶和乙醇脫氫酶的組成成分，它們在細(xì)胞內(nèi)的合成量增加從而使酶活性增強，也可能是Zn2+作為脫氫酶的激活劑使酶活性增強。

4 小結(jié)

本文使用平皿培養(yǎng)法，研究3種重金屬Pb2+、Zn2+和Cd2+單一脅迫對鹽地堿蓬種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，只有Zn2+在低濃度下對鹽地堿蓬種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和根系活力有促進(jìn)作用。Pb2+、Cd2+對種子萌發(fā)各指標(biāo)的影響均表現(xiàn)為隨濃度的升高抑制作用逐漸增強，Zn2+在高濃度下對種子萌發(fā)各指標(biāo)的抑制作用也隨濃度增加而增強。