吳雨佳， 申士富， 錢 靜， 劉 廷， 李俊松， 趙永貴， 狄留慶

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210046；2.青海源興工貿(mào)有限公司，青海西寧 810000)

蠶豆(ViciafabaL.)又稱羅漢豆、胡豆、蘭花豆、南豆、豎豆、佛豆，它屬于豆科、野豌豆屬。蠶豆在我國具有2 000年的栽培歷史，是我國主要的農(nóng)作物，主要產(chǎn)地包括南方的四川、重慶、湖南、湖北、江蘇、浙江、廣東等以及北方的青海、陜西、山東、山西等[1]。青海蠶豆由于地產(chǎn)海拔高的地區(qū)，因而籽粒大而飽滿、顏色乳白鮮亮、無蟲(豆象)的特點(diǎn)，是世界上最好的蠶豆之一[2]。蠶豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、膳食纖維、微量元素等，還含有一些生理活性物質(zhì)，包括原花青素和左旋多巴。原花青素主要分布于蠶豆皮中，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，它具有抗氧化、抑菌、抗癌和抗突變等生理活性[3]。蠶豆中因含有左旋多巴(L-DOPA)，被用作治療帕金森癥、高血壓、腎功能衰竭和肝硬化的膳食補(bǔ)充劑[4]。本研究對(duì)蠶豆的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)建立了標(biāo)準(zhǔn)，采用紫外可見分光光度法(UV)和高效液相色譜法(HPLC)分別測(cè)定了青海蠶豆中標(biāo)志性成分原花青素、左旋多巴的含量，完善了其品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比較不同品種不同產(chǎn)地青海蠶豆的差異，對(duì)于青海蠶豆品種的優(yōu)選、種植環(huán)境的選擇以及青海蠶豆多元化產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的參考價(jià)值。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器

TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，美國Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)(2998 PDA檢測(cè)器)，漢邦ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，Anke TGL-16C高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試劑

原花青素、左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用)，甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，十二水硫酸鐵銨(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙醇、乙酸、鹽酸、正丁醇均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)材料

青海12號(hào)、青海13號(hào)以及馬牙蠶豆的不同產(chǎn)地樣品，均由青海源興工貿(mào)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果分析

2.1 感官指標(biāo)檢測(cè)方法與結(jié)果

將產(chǎn)品置于潔凈無色透明的玻璃盤中，于自然光或相當(dāng)于自然光的室內(nèi)，用觸覺鑒別其組織狀態(tài)，視其色澤、雜質(zhì)，嗅其氣味，品其滋味。結(jié)果表明，不同來源青海蠶豆感官檢查均符合規(guī)定要求，因此建立青海蠶豆感官指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

表1 青海蠶豆感官指標(biāo)

2.2 理化指標(biāo)測(cè)定方法與結(jié)果

取不同來源的青海蠶豆，分別進(jìn)行各營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定。粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定，方法參考GB/T 5009.5—2010；粗脂肪含量測(cè)定，方法參考GB/T 5009.6—2003；粗纖維含量測(cè)定，方法參考GB/T 5009.10—2003；淀粉含量測(cè)定，方法參考GB/T 5009.9—2008；氨基酸含量測(cè)定，方法參考GB/T 5009.124—2003。按照表2相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)方法，分別對(duì)不同來源青海蠶豆進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果表明不同來源青海蠶豆各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合規(guī)定。

2.3 青海蠶豆中營(yíng)養(yǎng)類成分的檢測(cè)結(jié)果與分析

表2 不同來源青海蠶豆理化指標(biāo)檢查

由表3可知，不同來源青海蠶豆的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，其中以青海13號(hào)蠶豆最佳，其粗蛋白質(zhì)含量最高為34.4%，粗脂肪含量最高，為1.3%，粗纖維含量最高，為10.42%，淀粉含量較高，為49.1，氨基酸含量最高，為27.513%。

表3 青海蠶豆中營(yíng)養(yǎng)類成分的比較分析

2.4 青海蠶豆原花青素含量測(cè)定與結(jié)果分析

2.4.1 供試品溶液的制備 取不同來源青海蠶豆皮粉1 g，精確稱定，置于錐形瓶中，加50 mL 50%乙醇溶液，稱質(zhì)量，60 ℃ 水浴1 h，待冷卻后用50%乙醇溶液補(bǔ)足失質(zhì)量，離心(6 000 r/min，7 min)，取上清液作為供試品溶液[5]。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取原花青素對(duì)照品適量，精確稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解制成1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確吸取對(duì)照品溶液，分別配制不同濃度原花青素對(duì)照品溶液(75、150、225、300、375 μg/mL)，移取各對(duì)照品溶液2 mL，加入15 mL 5%鹽酸正丁醇溶液及0.5 mL 2%硫酸鐵銨溶液，100 ℃水浴加熱40 min，以試劑空白為對(duì)照，冷卻后于波長(zhǎng)554 nm處測(cè)定吸光度，以原花青素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。本研究結(jié)果表明，回歸方程為y=0.002 3x+0.006 1，r=0.999 1，原花青素在75～375 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.4.4 樣品含量測(cè)定與結(jié)果分析 精確吸取樣品溶液 2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中原花青素含量。由表4結(jié)果可知，3個(gè)品種18個(gè)產(chǎn)地的蠶豆原花青素平均含量為2.052%，幅度為1.492%～2.815%，變異系數(shù)為18.378%，變幅較大。原花青素含量偏度系數(shù)為 0.448，為正偏(朝左)，峰度系數(shù)為-0.574，分布較平坦。

表4 3種不同來源青海蠶豆中原花青素和左旋多巴含量測(cè)定結(jié)果

2.5 青海蠶豆左旋多巴含量測(cè)定與結(jié)果分析

2.5.1 色譜條件 參考宋江峰等的研究[7]，色譜柱：漢邦ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.1 mol/L 冰乙酸溶液(5 ∶95)；流速：0.8 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。青海蠶豆左旋多巴的高效液相色譜圖見圖1。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取左旋多巴對(duì)照品適量，精確稱定，加鹽酸溶液配成每1 mL含405.8 μg左旋多巴的溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取不同來源青海蠶豆細(xì)粉 0.5 g，精確稱定，加入鹽酸乙醇溶液(9 mL鹽酸加85%乙醇至1 000 mL)20 mL，回流加熱1 h后，再于4 000 r/min離心10 min，取上清液5.0 mL于蒸發(fā)皿中60 ℃水浴上揮干，加入0.1 mol/L的乙酸溶液復(fù)溶(含有0.05%L-半胱氨酸作為抗氧劑)，定容至2 mL，經(jīng)14 000 r/min離心7 min，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確吸取0.405 8 mg/mL的對(duì)照品溶液適量，分別制成不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=19 618x+7 753.3，線性范圍為 3.17～405.8 μg/mL，r=0.999 9，表明線性關(guān)系良好。

2.5.5 樣品含量測(cè)定 根據(jù)“2.5.3”節(jié)制備供試品溶液，并在同一色譜條件下進(jìn)樣分析。由表4中3個(gè)品種不同來源青海蠶豆左旋多巴的含量結(jié)果可知，蠶豆左旋多巴平均含量為346.31 μg/g，幅度為235.65～639.74 μg/g，變異系數(shù)為 30.511%，變幅很大。左旋多巴含量偏度系數(shù)為1.455，為正偏(朝左)，且偏離程度較大，峰度系數(shù)為2.289，分布較陡峭。3個(gè)品種原花青素含量均值由高到低分別為青海13號(hào) 2.178%，青海12號(hào)2.053%，馬牙蠶豆1.902%。3個(gè)品種左旋多巴含量均值由高到低分別為青海13號(hào)388.38 μg/g，青海12號(hào)376.56 μg/g，馬牙蠶豆272.02 μg/g。

3 結(jié)果與討論

相同品種不同產(chǎn)地的青海蠶豆原花青素、左旋多巴含量比較結(jié)果表明，5個(gè)不同產(chǎn)地青海12號(hào)蠶豆原花青素含量的平均值為2.053%，幅度為1.651%～2.505%，變異系數(shù)為15.838%。左旋多巴含量的平均值為376.56 μg/g，幅度為309.66～474.25 μg/g，變異系數(shù)為17.502%。7個(gè)不同產(chǎn)地的青海13號(hào)蠶豆原花青素平均含量為2.178%，幅度為 1.492%～2.815%，變異系數(shù)為21.525%。左旋多巴含量的平均值為388.38 μg/g，幅度為240.33～639.74 μg/g，變異系數(shù)為35.679%。6個(gè)不同產(chǎn)地的馬牙蠶豆原花青素平均含量為1.902%，幅度為1.611%～2.272%，變異系數(shù)為 15.386%。左旋多巴含量的平均值為272.02 μg/g，幅度為235.65～325.70 μg/g，變異系數(shù)為13.889%。青海12號(hào)蠶豆中，產(chǎn)自湟中縣攔隆口鎮(zhèn)橋西村的蠶豆原花青素含量最高(2.505%)，產(chǎn)自湟中縣攔隆口鎮(zhèn)上寺村的蠶豆最低(1.651%)；產(chǎn)自湟中縣李家山鎮(zhèn)包家莊村的蠶豆左旋多巴含量最高(474.25 μg/g)，產(chǎn)自湟中縣攔隆口鎮(zhèn)橋西村的蠶豆最低(309.66 μg/g)。青海13號(hào)蠶豆中，產(chǎn)自互助縣西山鄉(xiāng)和平村的蠶豆原花青素含量最高(2.815%)，產(chǎn)自互助縣東山鄉(xiāng)的蠶豆最低(1.492%)；產(chǎn)自互助縣南門峽鎮(zhèn)的蠶豆左旋多巴含量最高(639.74 μg/g)，產(chǎn)自共和縣恰卜恰鎮(zhèn)乙浪堂村的蠶豆最低(240.33 μg/g)。青海馬牙蠶豆中，產(chǎn)自共和縣龍羊鎮(zhèn)德勝村的蠶豆原花青素含量最高(2.272%)，產(chǎn)自湟源縣和平鄉(xiāng)大高陵村的蠶豆最低(1.611%)；產(chǎn)自湟源縣大華鎮(zhèn)拉卓奈村(水地)的蠶豆左旋多巴含量最高(325.70 μg/g)，產(chǎn)自湟源縣波航鄉(xiāng)甘溝村的蠶豆最低(235.65 μg/g)。

本研究對(duì)青海蠶豆3個(gè)品種感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和營(yíng)養(yǎng)類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，均符合規(guī)定，其中青海13號(hào)品種的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最為豐富。對(duì)青海3個(gè)品種18個(gè)產(chǎn)地的蠶豆進(jìn)行原花青素和左旋多巴進(jìn)行含量測(cè)定，分析結(jié)果表明青海蠶豆皮中原花青素和左旋多巴的含量較豐富，其中青海13號(hào)為最優(yōu)品種，原花青素和左旋多巴含量均比較高。18個(gè)產(chǎn)地蠶豆左旋多巴的含量較原花青素的含量差異大，說明左旋多巴比原花青素更易受基因和環(huán)境的影響，且相同品種不同產(chǎn)地的蠶豆2種生物活性物質(zhì)的含量差異較大，這可能跟各個(gè)地域的土壤、氣候、種植方式等因素有關(guān)。

青海蠶豆?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)豐富，并且存在大量的優(yōu)質(zhì)生物活性物質(zhì)例如原花青素和左旋多巴，具有很大的開發(fā)價(jià)值。通過建立蠶豆的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，比較不同來源青海蠶豆中營(yíng)養(yǎng)類物質(zhì)、原花青素和左旋多巴含量的差異，進(jìn)一步完善了蠶豆的品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為選擇蠶豆作為保健品原料提供了理論依據(jù)，并為蠶豆的深層次開發(fā)利用創(chuàng)造了有利條件。