孫宏蕾， 姜澤東， 計(jì)舒文， 王藝斐， 王 瓊， 張順云， 張 敖， 朱延姝

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，其主要功能為提供植物生長發(fā)育的有機(jī)營養(yǎng)。葉片若發(fā)生衰老，將導(dǎo)致光合作用降低和停止[1]。葉片衰老受秋季低溫和短日照誘導(dǎo)[2]，在該階段，強(qiáng)光和干旱等環(huán)境脅迫促進(jìn)衰老[1，3]。然而，對于多年生植物，適時(shí)和適當(dāng)速率的衰老有利于葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到其他延存器官中，為它們順利越冬和來年延存器官生長提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)。活性氧的產(chǎn)生和清除之間的平衡是控制葉片衰老速率的關(guān)鍵因子之一。活性氧產(chǎn)生將誘發(fā)和促進(jìn)葉片的衰老[4]，而活性氧的清除機(jī)制將減輕或減緩活性氧的這種作用[5-6]。葉片衰老過程伴隨著葉片顏色的變化[7]，葉綠素、類胡蘿卜素、花色素的含量和比值發(fā)生變化[8]。當(dāng)葉片對CO2的同化能力降低時(shí)，葉綠素會(huì)將利用所吸收的光能產(chǎn)生活性氧[9]。與之相反，類胡蘿卜素和花色素則具有清除活性氧的作用[10-12]。因此，葉片的吸收光譜和葉綠素與類胡蘿卜素和花青素的比值將影響植物體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而影響葉片的衰老速率。爬山虎(ParthenocissustricuspidataPlach.)屬葡萄科多年生落葉藤本植物，其葉片顏色在秋季發(fā)生顯著變化[13-14]，是研究色素與葉片衰老之間關(guān)系的理想材料。本研究測定秋季爬山虎不同顏色葉片的葉綠素、類胡蘿卜素、花色素含量，以及同一階段的葉片熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)和吸收光譜，分析葉片衰老過程中葉綠素與類胡蘿卜素和花色素比值變化與葉片熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)和吸收光譜的關(guān)系，以期為植物秋季葉片衰老速率調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)(41°49′N，123°34′E)生長的爬山虎。于2016年10月上旬晴天的上午，選取不同枝條上生長一致的綠色、黃色、紅色葉片測定吸收光譜、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線，以及葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素、花色素含量。

1.2 方法

吸收光譜測定：3種顏色的爬山虎葉片各5片，用英國漢莎公司的Unispec-SC單通道便攜式光譜儀(PP-Systems)測定吸收光譜。

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線測定：測定吸收光譜后，用葉夾夾住葉片中部暗適應(yīng)30 min，用英國漢莎公司的植物效率儀(Handy PEA)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。飽和脈沖光的光強(qiáng)為 3 000 μmol/(m2·s)，持續(xù)時(shí)間為1 s。熒光參數(shù)Fo為初始熒光，F(xiàn)m為最大熒光，F(xiàn)v為可變熒光，F(xiàn)v/Fm為PSⅡ最大光化學(xué)效率，Wk為PSⅡ供體側(cè)傷害指數(shù)，ETo/RC為反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量，DIo/RC為反應(yīng)中心的熱耗散，RC/CSm為單位面積反應(yīng)中心的數(shù)量(t=Fm)。

光合色素含量測定：將測定吸收光譜和葉綠素?zé)晒鈪?shù)后的葉片剪下，參考黃秋嬋等方法[15-16]，用95%乙醇浸提，測定474、485、645、663 nm下的吸光度，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素、葉黃素含量。花色素含量測定參照桂克印等的方法[17]，用1%的鹽酸甲醇浸提，測定530 nm下的吸光度，計(jì)算花色素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

熒光參數(shù)和吸收光譜使用Microsoft Office Excel與SPSS 17.0進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同顏色葉片的色素含量比較

從表1可以看出爬山虎3種不同顏色葉片色素含量的差異。綠色葉、紅色葉、黃色葉的葉綠素(a+b)含量依次降低，綠色葉與紅色葉和黃色葉的含量差異極顯著；葉綠素a、葉綠素b含量變化趨勢與葉綠素(a+b)含量變化趨勢一致，3種葉片間的差異水平也一致。3種葉片中的類胡蘿卜素含量依次降低，綠色葉與紅色葉和黃色葉的含量差異極顯著。3種不同顏色葉片胡蘿卜素含量變化與類胡蘿卜素含量變化一致，且3種顏色葉片之間差異極顯著。綠色葉的葉黃素含量高于黃色葉，三者差異極顯著，紅色葉的葉黃素含量沒有測出。花色素在紅色葉中含量最高，綠色葉次之，黃色葉最少，紅色葉與綠色葉和黃色葉差異極顯著。葉綠素a/葉綠素b、葉綠素(a+b)/類胡蘿卜素、葉綠素(a+b)/花色素的比值從大到小分別是綠色葉、紅色葉、黃色葉。

表1 爬山虎3種不同顏色葉片的色素含量比較

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫、大寫字母分別表示不同顏色葉片差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，表2同。

2.2 爬山虎不同顏色葉片的吸收光譜比較

從圖1可以看出，爬山虎3種不同顏色葉片吸收光譜存在明顯差異。在310～410 nm、710～1 110 nm范圍內(nèi)，爬山虎3種顏色葉片的吸收光譜幾乎重合；在410～710 nm范圍內(nèi)，綠色葉吸收光譜的趨勢先小幅降低，然后在680 nm處出現(xiàn)峰值，出現(xiàn)峰值后迅速降低；紅色葉、綠色葉的吸收光譜趨勢基本一致，但在680 nm峰值處，紅色葉吸收光譜低于綠色葉；黃色葉的吸收光譜明顯低于紅色葉和綠色葉。每種色素吸收光的能力不同，其中葉綠素是吸收光能的主要色素，黃色葉明顯低于綠色葉和紅色葉，說明黃色葉中的葉綠素含量較少。

2.3 不同顏色葉片的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線和參數(shù)比較

從圖2可以看出，爬山虎3種不同顏色葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線存在明顯差異。綠色葉片的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線均呈現(xiàn)該曲線的典型特征，O-J-I-P各點(diǎn)非常明顯；紅色葉片的熒光動(dòng)力學(xué)曲線特征不夠明顯，除O點(diǎn)比較清晰外，其他各點(diǎn)難以辨認(rèn)；黃色葉片的熒光動(dòng)力學(xué)曲線特征不夠明顯，O-J-I-P各點(diǎn)均難以辨認(rèn)。

從表2可以看出，爬山虎3種不同顏色葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)存在明顯差異。爬山虎葉片的初始熒光(Fo)從紅色葉到黃色葉再到綠色葉依次減小，說明PSⅡ反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，色素吸收光能傳遞給反應(yīng)中心的效率降低，PSⅡ反應(yīng)中心活性降低。從綠色葉到紅色葉再到黃色葉最大熒光產(chǎn)量(Fm)大幅降低，PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)也呈現(xiàn)依次降低的趨勢，且黃色葉與綠色葉和紅色葉存在極顯著差異，說明隨著植物葉片的衰老，光合作用的能量利用效率降低，PSⅡ 活性受到了抑制，與Fo相一致。反應(yīng)中心的熱耗散(DIo/RC)依次升高，說明在葉片衰老過程中單位反應(yīng)中心有越來越多的能量不用于光反應(yīng)，而是以其他方式被耗散掉。爬山虎綠色葉片光反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量(ETo/RC)高于紅色葉而低于黃色葉，說明從綠色葉到紅色葉光反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量減少，從綠色葉到黃色葉光反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量增加，ETo/RC與反應(yīng)中心的數(shù)量有關(guān)。單位面積的反應(yīng)中心數(shù)量(RC/CSm)表現(xiàn)為綠色葉最多，紅色葉次之，黃色葉最少，表明與綠色葉相比，紅色葉的反應(yīng)中心受傷害程度更深，與紅色葉相比，黃色葉的反應(yīng)中心受傷害程度更深。PSⅡ供體側(cè)傷害指數(shù)(Wk)的變化表現(xiàn)為黃色葉最大，紅色葉次之，綠色葉最小，表明黃色葉的PSⅡ供體側(cè)傷害程度最深。

表2 爬山虎3種不同顏色葉片的熒光參數(shù)比較

3 討論與結(jié)論

由于秋季氣溫降低，植物光合器和光合酶活性下降[18]，但是此時(shí)往往光照充足[19]，使光反應(yīng)速率與暗反應(yīng)速率不匹配，結(jié)果導(dǎo)致光合器內(nèi)產(chǎn)生過剩激發(fā)能，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生[20]。在樹木等多年生植物秋季葉片中，活性氧的產(chǎn)生一方面啟動(dòng)衰老[21-22]，開始葉片內(nèi)含物質(zhì)的分解和向越冬器官的轉(zhuǎn)移[23-24]；另一方面，活性氧產(chǎn)生過多也會(huì)導(dǎo)致葉片衰老過快，引起其過早脫落而來不及將可以轉(zhuǎn)移的內(nèi)含物質(zhì)全部轉(zhuǎn)移出去[5]，造成光合同化產(chǎn)物質(zhì)的浪費(fèi)。因此，調(diào)節(jié)樹木秋季葉片的活性氧數(shù)量是控制葉片內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，而且不同顏色的葉片可能具有不同的機(jī)制。

在秋季，導(dǎo)致植物葉片顏色變化的主要原因是葉綠素、類胡蘿卜素和花色素含量之間的相對變化。本研究中，爬山虎黃色葉片的葉綠素含量在3種顏色葉片中最低，葉綠素與類胡蘿卜素的比值約為1，含量最高的色素是花色素，葉綠素與花色素的比值約為0.05。葉片中活性氧主要由葉綠素吸收的過剩光能產(chǎn)生[25-26]，而類胡蘿卜素和花色素具有清除活性氧的功能[27-30]。在秋季，黃色葉片的葉綠素含量降低，可見光吸收顯著降低，失去熒光動(dòng)力學(xué)曲線的典型特征，活性反應(yīng)中心數(shù)量減少，光化學(xué)活性顯著降低，表明黃色葉片降低了活性氧的產(chǎn)生能力。相反，類胡蘿卜素和花色素含量的相對增加則加強(qiáng)了葉片清除活性氧的能力，從而有利于葉片緩慢有序衰老。本研究結(jié)果表明，盡管爬山虎黃色葉片顯示為黃色，但清除活性氧的主要色素可能是花色素。

爬山虎紅色葉片的葉綠素含量也在非常低的水平上，花色素含量大大超過葉綠素含量，也含有超過黃色葉片的類胡蘿卜素，但葉黃素未檢出，可見光吸收光譜正常，熒光動(dòng)力學(xué)曲線除O點(diǎn)比較清晰外，其他各點(diǎn)很難辨認(rèn)，基本上失去其典型特征，盡管光化學(xué)活性較高和活性反應(yīng)中心數(shù)量較大，但可能是花色素干擾的結(jié)果。表明紅色葉片與黃色葉片同樣降低了活性氧的產(chǎn)生能力，而且清除活性氧的主要色素是花色素。

爬山虎綠色葉片的葉綠素含量水平較高，類胡蘿卜素含量也較高，遠(yuǎn)大于黃色葉片，花色素含量也高于黃色葉片，可見光吸收光譜與紅色葉片相似，熒光動(dòng)力學(xué)曲線O-J-I-P各點(diǎn)非常明顯，具有其典型特征，光化學(xué)活性較高和活性反應(yīng)中心數(shù)量較大。表明綠色葉片還具有較強(qiáng)的產(chǎn)生活性氧的能力，過多活性氧的清除依賴類胡蘿卜素和花色素的共同作用。