羅安才， 閻曉靈， 李利霞， 趙正武， 唐安軍

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400047)

雞爪槭(Acerpalmatum)是槭樹科槭屬植物，典型的彩葉樹種，隨著秋季光合作用產(chǎn)物的變化，葉片中色素種類、含量和比例會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，從而導(dǎo)致葉片顏色改變[1]。但是目前關(guān)于槭樹科植物葉色變化的研究主要集中在環(huán)境因素、色素含量及可溶性糖等生理指標(biāo)變化方面[2-7]，沒有關(guān)于某一特定品種雞爪槭葉色變化的系統(tǒng)性研究，如關(guān)于細(xì)葉雞爪槭葉片常年是綠色而紫紅葉雞爪槭葉片常年是紅色的原因是什么，還不曾有人進(jìn)行探究；分子方面關(guān)于顏色變化相關(guān)基因準(zhǔn)確定位的研究也沒有報(bào)道。本研究以3種雞爪槭為研究材料，測量雞爪槭變色期相關(guān)生理指標(biāo)，通過比對(duì)及差異性分析，探究紫紅葉雞爪槭葉片變紅的機(jī)制，并用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)[8]初步探索控制雞爪槭葉片顏色改變的基因，從而為雞爪槭在景觀配置中多彩化和合理化應(yīng)用提供一定的參考，為彩葉植物新品種的引進(jìn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究材料采自重慶市南山植物園，取生長條件相同的紫紅葉雞爪槭(Acerpahnatumcv.atmpurpureum)、細(xì)葉雞爪槭(Acerpahnatumcv.dissectum)和血紅楓(Acerpahnatumcv.atropurpureum)的新鮮葉片，于2014年5—11月共7個(gè)月，每月的28日10：00定時(shí)采集，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室貯存于 -80 ℃ 的超低溫冰箱中。

1.2 生理指標(biāo)的測定

將采集的新鮮葉片洗凈擦干，去掉葉脈和葉柄，剪碎后混合均勻，作為樣品以備后續(xù)試驗(yàn)。每組試驗(yàn)測量3次，測得數(shù)據(jù)用Excel作圖，用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析(α=0.05 或α=0.01)。

1.2.1 含水量的測定 稱量樣品的鮮質(zhì)量(FW)，105 ℃烘箱內(nèi)烘烤8 h，稱其干質(zhì)量(DW)。含水量(RWC)的計(jì)算公式：RWC=(FW-DW)/FW×100%。

1.2.2 葉綠素含量的測定 精準(zhǔn)稱取0.1 g樣品烘干，加 10 mL 無水乙醇和80%丙酮混合液提取[9]，以80%丙酮為對(duì)照測上清液分別在645、663 nm下的吸光度(D)。計(jì)算公式：

葉綠素a含量(mg/g)=(12.71D663 nm-2.59D645 nm)×V/(1 000DW)；

葉綠素b含量(mg/g)=(22.88D645 nm-4.67D663 nm)×V/(1 000DW)；

葉綠素總含量(mg/g)=(8.04D663 nm+20.29D645 nm)×V/(1 000DW)。

1.2.3 花色素苷、類黃酮和總酚含量的測定 精準(zhǔn)稱取 0.1 g 樣品烘干，加5 mL 0.1%的鹽酸乙醇混合液提取[10]，以提取液作對(duì)照，分別測定530 nm、320 nm、280 nm處的吸光度。

花色素苷相對(duì)含量(mg/g)=D530 nm/DW；

類黃酮相對(duì)含量(mg/g)=D320 nm/DW；

總酚相對(duì)含量(mg/g)=D280 nm/DW。

1.2.4 可溶性糖含量的測定 精準(zhǔn)稱取0.1 g樣品烘干，用蒽酮比色法[11]測量葉片中可溶性糖的含量。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定 精準(zhǔn)稱取0.5 g樣品烘干，加5 mL提取液提取粗酶液[12]，取1 mL粗酶液加 1 mL 苯丙氨酸(0.02 mol/L)和2 mL硼酸緩沖液，30 ℃恒溫水浴1 h，用0.2 mL HCl(6 mol/L)終止反應(yīng)，檢測290 nm處的吸光度。以測定管反應(yīng)液吸光度1 h增加0.01為1個(gè)酶活性單位(U)[13]。

PAL活性[U/(g·h)]=D290 nm×Vt×V/(0.01×Vs×DW×t)。

式中：Vt表示酶液總體積，mL；Vs表示測定時(shí)取酶液的量，mL；V表示反應(yīng)液總體積，mL；t表示反應(yīng)時(shí)間，h。

1.2.6 膽色素原(PBG)含量的測定 精準(zhǔn)稱量0.5 g樣品烘干，加5 mL提取液后沸水浴10 min，冷卻后加2 mL Ehrlich-Hg顯色[14-16]，測553 nm處的D值。

PBG含量(μg/g)=D553 nm×47×稀釋倍數(shù)。

1.2.7 5-氨基酮戊氨酸(ALA)含量的測定 精準(zhǔn)稱取 0.5 g 樣品充分研磨，加5 mL提取液提取，離心后取上清液加顯色劑顯色[17]，測553 nm處的D值。

ALA含量(μg/g)=D553 nm×47×稀釋倍數(shù)。

1.3 分子標(biāo)記

1.3.1 DNA的提取 用TaKaRa公司提供的試劑盒，按試劑盒所示步驟提取雞爪槭葉片DNA。

1.3.2 SRAP反應(yīng)體系 SRAP反應(yīng)體系組成詳見表1。SRAP-PCR 程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；前5個(gè)循環(huán)以94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min進(jìn)行，接著將退火溫度升至50 ℃，其他條件不變，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 SRAP反應(yīng)體系

1.3.3 SRAP標(biāo)記引物的篩選和PCR產(chǎn)物的檢測 SRAP引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，取DNA質(zhì)量較好的樣品(細(xì)葉雞爪槭)用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步的引物篩選，較好的引物組合再進(jìn)行復(fù)選。再用2%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，再用相機(jī)記錄差異條帶。

1.3.4 差異條帶的切割與純化和二次PCR 切下差異條帶進(jìn)行稱量，1 g凝膠對(duì)應(yīng)1 mL Binding Buffer，然后55～60 ℃水浴至膠溶解，再按步驟純化DNA。同樣體系中以純化后的DNA為模板進(jìn)行二次PCR，用丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小及單一性。

1.3.5 測序和比對(duì)分析 將二次PCR后的樣品送到上海英俊生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast數(shù)據(jù)比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理指標(biāo)測定結(jié)果與分析

由圖1-A可知，紫紅葉雞爪槭和細(xì)葉雞爪槭的含水量均在7月達(dá)到最高值，分別為66.32%和65.78%，在11月降到最低，分別為15.26%和10.47%。2個(gè)材料變化趨勢(shì)相近，不存在顯著性差異。

由圖1-B可知，在觀察期內(nèi)2種雞爪槭的葉綠素a和b的含量隨時(shí)間均呈現(xiàn)呈升—降變化趨勢(shì)，細(xì)葉雞爪槭和紫紅葉雞爪槭的葉綠素a含量均在7月最高，分別為10.29、3.03 mg/g；在11月含量最低，分別為0.59、0.62 mg/g。2種雞爪槭的葉綠素a在5—8月內(nèi)存在顯著性差異(P<0.05)，8月份后差異不顯著。細(xì)葉雞爪槭和紫紅葉雞爪槭的葉綠素b含量在7月最高，分別為11.04、3.63 mg/g；在11月含量最低，分別為1.09、0.91 mg/g。2種雞爪槭的葉綠素b含量僅在5、6月存在顯著性差異(P<0.05)。綜合得知，2種雞爪槭葉綠素a和葉綠素b的含量都是嫩葉和老葉含量低，成熟葉片含量高。

由圖1-C得知，在整個(gè)研究過程中，細(xì)葉雞爪槭葉綠素總含量呈單峰值，紫紅葉雞爪槭則隨時(shí)間呈雙峰值。細(xì)葉雞爪槭總?cè)~綠素含量最高在10月，達(dá)到10.15 mg/g，最低在5月，只有3.83 mg/g；紫紅葉雞爪槭的總?cè)~綠素含量最高在7月，有6.64 mg/g，這與夏季高溫返青現(xiàn)象有關(guān)，最低在11月，僅有1.56 mg/g。在5月后，細(xì)葉雞爪槭的葉綠素總含量總是大于紫紅葉雞爪槭，這與細(xì)葉雞爪槭常年綠色相關(guān)。2種雞爪槭葉綠素總含量在6、9、10這3個(gè)月存在顯著性差異(P<0.05)，7、8月間差異不顯著。

分析圖1-D，在整個(gè)觀察期，2種雞爪槭花色素苷的相對(duì)含量變化趨勢(shì)因品種不同而存在顯著差異。細(xì)葉雞爪槭花色素苷的相對(duì)含量在5—6月略微升高，嫩葉呈淡淡的紫紅色；6—9月緩慢下降，達(dá)到最低值(2.28 mg/g)，成熟葉片呈綠色；10月花色素苷的相對(duì)含量上升，達(dá)到最高值(5.01 mg/g)，老葉變黃；11月下降。紫紅葉雞爪槭在5、8、10月含量較高，8月最高，達(dá)10.01 mg/g，葉片鮮艷，適宜觀賞；6、9、11月含量低，9月最低，為3.12 mg/g，葉片顏色變成紫紅色。

花色素苷含量和葉綠素含量的比值是評(píng)價(jià)葉色變化的標(biāo)準(zhǔn)之一，比值越大，葉片顏色越紅[18]。由圖1-E可知，紫紅葉雞爪槭的比值總是大于細(xì)葉雞爪槭，細(xì)葉雞爪槭的比值趨于穩(wěn)定，而紫紅葉雞爪槭比值在每個(gè)時(shí)期都變化顯著，11月達(dá)到最大值2.857，7月比值最小，僅0.789。

由圖1-F可知，細(xì)葉雞爪槭類黃酮的相對(duì)含量呈升—降趨勢(shì)，紫紅葉雞爪槭呈降—升—降趨勢(shì)。2種雞爪槭都是11月含量最低，分別為5.35、5.59 mg/g；但細(xì)葉雞爪槭7月含量最高，達(dá)到11.82 mg/g，紫紅葉雞爪槭5月含量最高，達(dá)15.98 mg/g。分析得知，2個(gè)品種的雞爪槭在整個(gè)變色過程中類黃酮的相對(duì)含量沒有顯著性差異。

分析圖1-G，在整個(gè)變色過程中，細(xì)葉雞爪槭總酚的相對(duì)含量呈升—降趨勢(shì)，紫紅葉雞爪槭呈降—升—降趨勢(shì)。2個(gè)品種都是在11月含量最低，分別為30.46、43.74 mg/g；細(xì)葉雞爪槭總酚含量最高在7月，達(dá)到76.46 mg/g，而紫紅葉雞爪槭最高在5月，達(dá)110.99 mg/g。分析可知，2種雞爪槭總酚的相對(duì)含量變化沒有顯著性差異。

分析圖1-H，在整個(gè)觀察期，紫紅葉雞爪槭的可溶性糖含量均高于細(xì)葉雞爪槭，呈升—降趨勢(shì)。兩者均在7月達(dá)到最高值，分別為9.26、6.09 μg/g；在11月降到最低，分別為2.35、1.64 μg/g。分析可知，2種雞爪槭的可溶性糖含量在7—10月存在顯著差異(P<0.05)。

由圖1-I可知，細(xì)葉雞爪槭的PAL活性呈降—升—降趨勢(shì)，5月升至最高值，達(dá)到80.12 U/(g·h)，在8月時(shí)降到最低，只有6.80 U/(g·h)，紫紅葉雞爪槭則呈上升—下降趨勢(shì)，8月份升到最高值157.05 U/(g·h)，11月則降到最低值4.45 U/(g·h)。分析可知，2種雞爪槭的PAL活性呈顯著負(fù)相關(guān)，兩者間只有10月份差異不顯著，其余時(shí)間差異極顯著(P<0.01)。

由圖1-J可知，在整個(gè)研究過程中，細(xì)葉雞爪槭的ALA含量呈升-降趨勢(shì)，5月含量最低，為38.29 μg/g，9月份升至最高，達(dá)到63.61 μg/g；而紫紅葉雞爪槭呈升—降—升變化趨勢(shì)，5月含量最低，僅10.57 μg/g，7月含量最高，有 45.31 μg/g。整個(gè)調(diào)查期內(nèi)細(xì)葉雞爪槭的ALA含量均高于紫紅葉雞爪槭，兩者間在5月份差異不顯著，但在6、7月份差異極顯著(P<0.01)。

由圖1-K可知，2種雞爪槭的PBG含量均呈升—降趨勢(shì)，但細(xì)葉雞爪槭的PBG含量最高在10月，達(dá)到 66.36 μg/g，最低在5月，為18.42 μg/g；而紫紅葉雞爪槭PBG含量最高在6月，達(dá)37.79 μg/g，最低在11月，降至 9.59 μg/g。只有在6月份的時(shí)候細(xì)葉雞爪槭的膽色素原含量低于紫紅葉雞爪槭，其余時(shí)間都高于紫紅葉雞爪槭。2種雞爪槭的PBG含量在5、7月差異不顯著，在8—11月存在顯著差異性(P<0.05)。

2.2 SRAP結(jié)果分析

2.2.1 DNA的提取 DNA的濃度和純度用Spectrophoto meter ND-100全波長紫外分光光度儀進(jìn)行檢測，電泳圖如圖2所示。

2.2.2 引物的篩選 上下游引物各64條，共設(shè)計(jì)引物組合648對(duì)，其中246對(duì)引物組合初步篩選具有條帶。按照多態(tài)性好、條帶清晰、擴(kuò)增穩(wěn)定的原則進(jìn)行引物的初步篩選[19]，篩選出的引物組合分別為FM18-RM33、FM19-RM10、FM20-RM14、FM20-RM32、FM20-RM46、FM20-RM60、FM43-RM37、FM25-RM43、FM44-RM14、FM44-RM30、FM44-GM39、FM44-RM47、FM54-RM16。

2.2.3 差異條帶的切割和其引物組合 聚丙烯酰胺凝膠電泳共擴(kuò)增出2 591條清晰的條帶，其中1 093條細(xì)葉雞爪槭、721條紫紅葉雞爪槭、777條血紅楓。各個(gè)引物組合間存在較大差異，最多的可以擴(kuò)增出高達(dá)15條帶，最少的僅有1條。按照細(xì)葉雞爪槭沒有而紫紅葉雞爪槭和血紅楓有，或細(xì)葉雞爪槭有而紫紅葉雞爪槭沒有的原則進(jìn)行差異條帶的選取，從所有擴(kuò)增條帶中切割出42條不同品種的差異條帶，其中細(xì)葉雞爪槭占40.48%，紫紅葉雞爪槭和血紅楓的共同差異條帶占5.52%。

2.2.4 二次PCR 二次PCR后篩選出13個(gè)單一且清晰的條帶進(jìn)行測序，拼接出6個(gè)條帶的序列，詳見表2。

表2 拼接序列引物

2.2.5 測序及其分析比對(duì) 用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸Blast數(shù)據(jù)比對(duì)分析，但由于沒有完整的雞爪槭數(shù)據(jù)庫，所以只能進(jìn)行相似序列的比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果顯示：拼接出的6條序列沒有發(fā)現(xiàn)同源序列，沒有找到相對(duì)應(yīng)的信息，說明這部分序列還沒有相關(guān)研究，下一步可以作為研究的重點(diǎn)。

3 討論

3.1 生理指標(biāo)測定結(jié)果討論

含水量反映了植物組織水分生理狀況，直接影響植物的生長。檢測雞爪槭葉片含水量可知，2種雞爪槭都是新鮮成熟葉片含水量高于老葉，這表明新陳代謝越旺盛，含水量越高，而植物葉片含水量與葉片顏色變化沒有顯著相關(guān)性。

植物葉片顏色一般由葉綠素和花色素苷的含量和分布決定[5]。本研究中細(xì)葉雞爪槭的葉綠素總含量總是大于紫紅葉雞爪槭，所以細(xì)葉雞爪槭葉片常年比紫紅葉雞爪槭綠。而2種雞爪槭的花色素苷的相對(duì)含量變化趨勢(shì)因品種不同而存在顯著差異，當(dāng)葉片中花色素苷含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)(60%～80%)，葉片呈紅色[7]。但是胡敬志等認(rèn)為花色素苷含量穩(wěn)定，葉片pH值下降是葉片變紅的主要原因[20]，這與前人的結(jié)論存在差異。

花色素苷和葉綠素的比值是評(píng)價(jià)葉色變化的標(biāo)準(zhǔn)，本研究中紫紅葉雞爪槭的比值在5、8、10、11月比值最大，此時(shí)葉片顏色最鮮艷；細(xì)葉雞爪槭的比值趨于平穩(wěn)，故葉色沒有較大變化。由此可見，葉片變紅程度與花色素苷含量與葉綠素含量比值呈正相關(guān)關(guān)系，這與前人的研究結(jié)果[21]一致。

有研究表明，花色素苷在多酚氧化酶、過氧化物酶、花色素苷酶等的作用下可以降解成酚類物質(zhì)[22-24]，總酚是所有酚類物質(zhì)，類黃酮也屬于酚類。在本研究中，2種雞爪槭的總酚和類黃酮含量變化沒有顯著差異，故與葉片顏色變化沒有顯著相關(guān)性。

可溶性糖是植物組織中所存儲(chǔ)的營養(yǎng)物質(zhì)，供植物生長發(fā)育使用，是植物代謝活動(dòng)的主要參與者。趙建鋒發(fā)現(xiàn)秋季植物體內(nèi)一些復(fù)雜的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為糖類，直接促進(jìn)了花青素的累積，葉片就呈現(xiàn)紅色[25]。本研究中紫紅葉雞爪槭的可溶性糖含量隨葉片變紅而逐漸增加，而細(xì)葉雞爪槭由于常年綠色，可溶性糖含量在整個(gè)觀察期都低于紫紅葉雞爪槭，這與聶慶娟等的研究結(jié)果[26]一致，表明可溶性糖含量的增加可顯著促進(jìn)葉片中花色素苷的積累，進(jìn)而影響葉片顏色變化。這與李倩等研究早熟桃葉葉色變化得到的結(jié)果[27]相同。

苯丙氨酸解氨酶是控制初級(jí)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭?jí)代謝的分支點(diǎn)，是形成酚類化合物中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)酶[13]，而酚類物質(zhì)的含量與花色素苷的降解有關(guān)。在本研究中細(xì)葉雞爪槭的PAL活性隨時(shí)間呈降—升—降變化趨勢(shì)，紫紅葉雞爪槭則呈升—降的變化趨勢(shì)，這可能是由于秋季花色素苷的大量合成消耗了大量的PAL[28]。2種雞爪槭的PAL活性呈顯著的負(fù)相關(guān)性，與葉色變化具有顯著相關(guān)性。

葉綠素的合成分為4個(gè)階段[29]，ALA和PBG都是葉綠素合成前期必不可少的物質(zhì)，它們的含量與葉綠素含量正相關(guān)，ALA和PBG含量越低，葉片越紅。

3.2 SRAP結(jié)果分析討論

分子實(shí)驗(yàn)一共擴(kuò)增出1 093條細(xì)葉雞爪槭條帶，721條紫紅葉雞爪槭和777條血紅楓條帶，其中篩選出42條特異性條帶，最終選擇來自13對(duì)引物組合的13條清晰穩(wěn)定的差異條帶進(jìn)行測序，有6對(duì)引物組合測序成功。

由于槭樹科植物沒有數(shù)據(jù)庫提供比對(duì)序列，只能進(jìn)行相似序列的比對(duì)。結(jié)果沒有找到相似度較高的同源序列，可能是因?yàn)槟壳皼]有該序列的相關(guān)研究，需要進(jìn)一步深入研究；也可能是因?yàn)楹Y選的引物數(shù)量不夠，還不足夠說明問題，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以加大引物篩選的數(shù)量以及差異條帶的數(shù)量，選擇出更有意義的序列。

4 結(jié)論

含水量和雞爪槭葉色變化沒有顯著相關(guān)性。葉綠素含量越高，葉片顏色越綠。5-氨基酮戊氨酸和膽色素原與葉綠素的合成相關(guān)。ALA和PBG含量越低，葉片越鮮艷。花色素苷是葉片呈現(xiàn)紅色的主要因素，含量越高葉片越紅?？扇苄蕴堑睦鄯e有利于花色素苷的合成，其含量越高，葉片越紅。苯丙氨酸解氨酶是控制花色素苷合成的第1個(gè)但不是唯一的關(guān)鍵酶，是類黃酮和酚類化合物合成的關(guān)鍵酶和控制酶，其含量的高低和葉片顏色有顯著的相關(guān)性，和花色素苷的含量呈一定的相關(guān)性，所以變色期紫紅葉雞爪槭要比細(xì)葉雞爪槭鮮艷。