魏 蜜， 朱潔倩， 陳嘉敏， 金文聞， 傅本重， 王立華， 李國(guó)元

(1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北孝感 432000；2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究所，湖北武漢 430074； 3.武漢生物技術(shù)研究院，湖北武漢 430075)

瑪咖(Lepidiummeyenii)是原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈的十字花科獨(dú)行菜屬草本植物[1]。瑪咖依據(jù)根莖外皮顏色差異分為紫色、黃色、白色、紅色等不同栽培品種，瑪咖根營(yíng)養(yǎng)及生物活性成分豐富，具有抗壓力、抗疲勞、抗抑郁、提高生育力等多種保健功效[2-3]。

瑪咖病害主要有霜霉病、根腫病、病毒病、根腐病等，國(guó)內(nèi)外對(duì)瑪咖病原菌及病理的研究報(bào)道相對(duì)較少[4]。2015年8—10月，筆者在全國(guó)多個(gè)瑪咖種植基地發(fā)現(xiàn)，瑪咖易患根腐病，會(huì)給栽培者造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。為明確瑪咖根腐病的病原物，筆者對(duì)瑪咖根腐病樣品進(jìn)行分離、純化，并完成柯赫氏法則驗(yàn)證分析。本研究以期為瑪咖病害的檢測(cè)鑒定提供參考，為促進(jìn)瑪咖的科學(xué)種植和田間管理提供參考，為更好地開發(fā)利用瑪咖藥食兩用的效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

瑪咖根腐病樣品采自云南省麗江市海拔2 700 m的華中科技大學(xué)校企合作瑪咖種植研究基地，瑪咖植株經(jīng)華中科技大學(xué)付春華副教授鑒定出。

1.2 病原菌的分離與純化

采用常規(guī)的組織分離法[5]進(jìn)行病原菌的分離和純化，從病樣病健交界處切取長(zhǎng)約3 cm的組織，用清水沖洗表面雜物，置于0.1%酸性氯化汞水溶液中2 min，取出用無菌水沖洗2次；用70%乙醇處理30 s后，再用無菌水沖洗3次，無菌條件下接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和溶菌肉湯(LB)平板培養(yǎng)基上。分別倒置放置在28 ℃和32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后挑取不同的單菌落進(jìn)一步劃線培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接純化3～5次。將純化后的單菌落編號(hào)并放置在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的致病性

分別采用離體塊莖組織接種法和盆栽試驗(yàn)進(jìn)行致病性研究。離體塊莖組織接種：將采回的健康瑪咖塊莖用無菌水洗凈，切成3 cm×3 cm×3 cm，置于75%乙醇中30 s，無菌水沖洗后，置于0.1% 氯化汞溶液中浸泡20 min，再用無菌水沖洗。在超凈工作臺(tái)中，用紫外線照射墊有濾紙的培養(yǎng)皿 30 min，用 2 mL 無菌水浸潤(rùn)濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿放2塊樣品，用滅菌的 1 mL 槍頭在瑪咖塊莖中央戳1個(gè)小孔，深度為2 mm，分別加入 10 μL 病原菌孢子懸液(濃度為1.0×107個(gè)/mL)，重復(fù)5次，用封口膜將培養(yǎng)皿口封住，加入 10 μL 無菌水的作為空白對(duì)照，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。盆栽試驗(yàn)：將試驗(yàn)盆中健康的瑪咖植株(生長(zhǎng)7個(gè)月)用 10 mL 濃度為1.0×107個(gè)/mL的病原菌孢子懸浮液進(jìn)行傷口接種，置于 25 ℃ 生化培養(yǎng)箱中，12 h光照處理，重復(fù)5次，同樣以無菌水接種植株為對(duì)照，每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 病原菌的形態(tài)鑒定

觀察平板菌落及顯微條件下病原菌菌絲和孢子的形態(tài)，分別測(cè)量100個(gè)病原菌孢子的大小和菌絲直徑，并記錄拍照。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[6]和相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，對(duì)各種孢子的形態(tài)特征進(jìn)行對(duì)比分析和鑒定。

1.5 病原菌的脂肪酸組成分析

病原菌菌落收集培養(yǎng)基(沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、脂肪酸提取試劑(皂化試劑、甲基化試劑、萃取試劑和洗滌試劑，美國(guó)Fisher公司提供)、脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣(美國(guó)MIDI公司提供)；制得的脂肪酸樣品由Agilent 6890型氣相色譜系統(tǒng)檢測(cè)，包括全自動(dòng)進(jìn)樣裝置、石英毛細(xì)管柱及氫火焰離子化檢測(cè)器；檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)比對(duì)分析通過微生物細(xì)胞脂肪酸成分鑒定軟件MIS4.5和LGS4.5完成。

1.6 病原菌的分子鑒定

病原菌的DNA提取參考何月秋的研究方法[10]。分別采用真菌的通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′)[11]，延長(zhǎng)因子序列分析引物ef1[5′-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3′]/ef2[5′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3′][12]和RNA聚合酶II第二大亞基(RPB2)序列分析的2對(duì)引物5f2[5′-GGGG(A/T)GA(C/T)CAGAAGAAGGC-3′]/7cr[5′-CCCAT(A/G)GCTTG(C/T)TT(A/G)CCCAT-3′]和7cf[5′-ATGGG(C/T)AA(A/G)CAAGC(C/T)ATGGG-3′]/11ar[5′-GC(A/G)TGGATCTT(A/G)TC(A/G)TC(C/G)ACC-3′][13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的PCR擴(kuò)增試劑盒(NO：B639297)進(jìn)行試驗(yàn)，PCR反應(yīng)總體系為51 μL，反應(yīng)液為DNA 2 μL，ITS4/ITS5[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]各2 μL、Mix 25 μL、雙蒸水20 μL。 PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共設(shè)35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；延長(zhǎng)因子序列分析時(shí)換ef1/ef2為引物，用量相同；RPB2序列分析時(shí)分別換 5f2/7cr 和7cf/11ar為引物，用量相同。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性驗(yàn)證

病原菌經(jīng)過分離、純化后，獲得一種在PDA培養(yǎng)基上呈圓形，等徑生長(zhǎng)的菌落。該菌落生長(zhǎng)初期為無色或灰白色，后漸變?yōu)樽霞t色，培養(yǎng)基基底中間呈褐色，外圍呈紫紅色，邊緣整齊(圖1-A、1-B)。菌絲細(xì)長(zhǎng)、分枝、分隔、濃密(圖1-C)。通過分離物的孢子懸液接種可使離體塊莖和盆栽中的瑪咖植株發(fā)病，且發(fā)病率為100%。植株發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似(圖2)，再次分離的病原物與自然發(fā)病分離的病原物一致。

2.2 病原菌形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，菌絲生長(zhǎng)茂盛，緊湊，初期無色，后在中心位置變?yōu)樽霞t色，逐步向外圍擴(kuò)展。菌絲有隔，分生孢子無色透明，大型分生孢子呈鐮刀形，稍彎曲，兩端漸細(xì)，具有2～5個(gè)隔膜，多為5個(gè)(圖1-C)。經(jīng)顯微測(cè)量，病原菌分生孢子大小為(2.5～6.0) μm×(8.2～22.3) μm，平均值為14.43 μm×4.1 μm；菌絲直徑為2.5～5.6 μm，平均值為 4.1 μm。依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[6]和參考文獻(xiàn)[7-9]，初步確定該分離物屬于半知菌亞門，瘤座菌目，鐮刀菌屬。

2.3 病原菌的脂肪酸鑒定

相似度(similarity index，簡(jiǎn)稱SI)是指待測(cè)菌株與系統(tǒng)譜庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)值的匹配程度。待測(cè)病原菌的脂肪酸氣相色譜如圖3所示，其中有18個(gè)組分與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的組成類似。系統(tǒng)比對(duì)結(jié)果(表1)表明，待測(cè)病原菌與頂孢霉菌屬、鐮刀菌屬的匹配度較高，相似度分別達(dá)到 0.696、0.625。一般來說，以最高SI菌種名稱作為鑒定結(jié)果，但當(dāng)其報(bào)告的幾個(gè)菌種的SI比較接近時(shí)，則根據(jù)色譜圖特征及菌落生長(zhǎng)特性進(jìn)行綜合判斷。根據(jù)“2.2”節(jié)中對(duì)病原菌形態(tài)特征的鑒定，初步判斷該病原菌為鐮刀菌。

2.4 病原菌的分子鑒定

對(duì)分離的病原菌進(jìn)行分子鑒定， 將測(cè)得的rDNA-ITS序列(片段長(zhǎng)度為557 bp，登錄號(hào)KU936793)與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，選取9株菌株用ClustalX 2.1進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA 6.0軟件采用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和聚類分析。如圖4所示，菌株ROT-2與GenBank中登錄號(hào)為KR047071.1、KP265365.1和FJ481029.1菌株的同源性均很高，不能判斷到底屬于鐮刀菌屬的哪個(gè)種，因此繼續(xù)對(duì)該菌株進(jìn)行延長(zhǎng)因子序列和RPB2序列分析，將測(cè)得的TEF序列(片段長(zhǎng)度為649 bp，登錄號(hào)KU999088)與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，ROT-2與GenBank中Fusariumavenaceumstrain CC39(EU744842.1)，F(xiàn)usariumavenaceumisolate M247(KP400697.1)和Fusariumavenaceumstrain F087(JX534426.1)菌株的同源性均達(dá)到99%。同時(shí)將測(cè)得的RPB2序列(片段長(zhǎng)度為760 bp)與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖5)顯示ROT-2與GenBank中Fusariumavenaceumstrain BBA 64151(HQ728167.1)和Fusariumavenaceumstrain NRRL 54939(JX171663.1)菌株的同源性均達(dá)到100%。結(jié)合形態(tài)、部分生理生化特征以及rDNA-ITS、TEF、RPB2序列分析，可鑒定病原菌ROT-2屬于燕麥鐮刀菌，并命名為F.avenaceumROT-2。

表1 脂肪酸鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)采自云南省麗江市瑪咖種植基地的瑪咖根腐病樣品進(jìn)行分離純化，然后對(duì)純化的病原物進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證工作，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征、脂肪酸組分分析以及rDNA-ITS、TEF、RPB2序列分析，將其鑒定為燕麥鐮刀菌。形態(tài)學(xué)特征鑒定主要參考魏景超主編的《真菌鑒定手冊(cè)》[6]和參考文獻(xiàn)[7-9]，對(duì)分生孢子形態(tài)、大小、顏色等主要特征進(jìn)行比較分析，分子鑒定除了采用真菌鑒定的通用引物ITS4/ITS5進(jìn)行rDNA-ITS序列分析外，還采用鑒定鐮刀菌屬的特異性引物ef1/ef2進(jìn)行延長(zhǎng)因子TEF序列分析和RPB2序列分析，該結(jié)果為首次報(bào)道燕麥鐮刀菌為瑪咖根腐病病原菌。

鐮刀菌在自然界中分布廣泛，不同國(guó)家和地區(qū)鐮刀菌的種類和致病性存在較大差異。研究報(bào)道，燕麥鐮刀菌可引發(fā)黑龍江省水稻立枯病[14]，也可引發(fā)青海省蠶豆根腐病[15]，還是黑龍江省馬鈴薯干腐病和甘肅省馬鈴薯枯萎病的病原菌之一，會(huì)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[16-17]。本研究從云南省麗江市的著名經(jīng)濟(jì)作物瑪咖根腐病樣品中篩選分離到1株病原菌，并鑒定為燕麥鐮刀菌，回接試驗(yàn)表明，該菌株可以導(dǎo)致健康瑪咖組織發(fā)生根腐病，產(chǎn)生與病株相同的癥狀，從接種的病株中以相同的方法也可分離出病原菌，且其特征與原病株分離物完全相同。本研究為開展瑪咖根腐病病害的深入研究和防治奠定了理論基礎(chǔ)，為解決瑪咖病害識(shí)別及科學(xué)防治提供了一定的參考，對(duì)保護(hù)、開發(fā)利用瑪咖資源有較大意義。