，，

(浙江省縉云縣動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 縉云 321400)

豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的E2蛋白是囊膜糖蛋白，也是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，研究表明E2蛋白是豬瘟病毒的一個重要免疫蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體從而提供保護(hù)性免疫，用E2蛋白免疫豬只，能有效抵御豬瘟強(qiáng)毒的攻擊。因此它已成為當(dāng)今豬瘟免疫和檢測研究的熱點(diǎn)，以E2蛋白抗體為檢測對象的阻斷ELISA在豬瘟抗體的監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中得到了充分的運(yùn)用。但是目前的豬瘟防疫尚以弱毒疫苗為主，其免疫血清都為多克隆抗體，而實(shí)驗(yàn)中多采用豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)，正是利用多克隆抗體能與抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集、沉淀的原理來檢測抗體效價(jià)。同時(shí)豬瘟免疫最易受到藍(lán)耳病毒PRRSV的免疫抑制干擾，產(chǎn)生免疫耐受，從而影響了除E2外其它多種抗體的產(chǎn)生，用正向間接血凝試驗(yàn)檢測顯示：PRRSV感染豬的豬瘟免疫，不但不能提升免疫抗體水平，甚至可下降至2 log直至1.5 log；但用豬瘟E2蛋白阻斷ELISA試驗(yàn)顯示：其受檢血清的抗體阻斷率則不受豬PRRSV免疫抑制干擾的影響，且與豬瘟間接血球凝集試驗(yàn)的合格與否和效價(jià)高低無關(guān)，與豬瘟IHA試驗(yàn)陽性結(jié)果高度相關(guān)。即當(dāng)PRRSV感染豬的豬瘟免疫的IHA效價(jià)下降為零合格率時(shí)，E2阻斷ELISA的合格率仍可高達(dá)90%，雖然兩種試驗(yàn)結(jié)果反差之大，可IHA試驗(yàn)的陽性結(jié)果則與E2蛋白阻斷ELISA的陽性結(jié)果有90%以上的符合率，即當(dāng)IHA試驗(yàn)為合格時(shí)同樣高度符合E2阻斷ELISA的試驗(yàn)結(jié)果，從而可推斷出E2蛋白的抗免疫抑制能力。了解這些現(xiàn)象的本質(zhì)，對做好豬瘟免疫及檢測工作，可能會有較重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30日齡PRRSV隱性感染豬，來自縉云縣某豬場，長勢一般，無可見臨床癥狀。

1.2 疫苗與試劑 豬瘟疫苗由中牧股份生產(chǎn)，批號：1712017-2；高致病性豬藍(lán)耳滅活苗由杭州/佑本生產(chǎn)，批號：170605；豬瘟間接血凝抗體檢測試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號：20171019202；IDEXX豬瘟病毒抗體檢測試劑盒來自于北京愛德士元亨生物科技有限公司REF99-43220 31-OCT-2018；LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測試劑盒來自于北京天之泰生物科技有限公司 批號MAY-2018。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組(均為PRRSV感染組)和對照組(PRRSV防疫組)，每組10頭。各組仔豬于30日齡時(shí)各肌注豬瘟疫苗2 mL/頭；對照組則同時(shí)分點(diǎn)肌注豬藍(lán)耳滅活苗2 mL/頭，注：豬瘟與藍(lán)耳分點(diǎn)注射。首免后2周，以上法同樣劑量加強(qiáng)免疫1次，分別于30 d、37 d、44 d、57 d、72 d、89 d、100 d、130 d、180 d時(shí)靜脈采血分離血清，用間接血凝法和阻斷ELISA法檢測豬瘟抗體效價(jià)，以間接ELISA法檢測豬藍(lán)耳抗體，再以間接血凝試驗(yàn)陽性阻斷ELISA陰性者，用豬瘟疫苗再行加強(qiáng)免疫，3周后采血檢驗(yàn)，如陰性結(jié)果則再免疫再檢驗(yàn)。

1.3.2 試驗(yàn)血清的檢驗(yàn)

1.3.2.1 豬瘟正向間接血凝試驗(yàn) 操作方法依據(jù)國家《豬瘟診斷技術(shù)》(GB/T16551-208)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。試驗(yàn)成立條件：對照孔無自凝現(xiàn)象，陽性對照血清抗體效價(jià)≥1∶256、陰性對照 ≤1∶8。為排除非特異性凝集，待檢血清使用前經(jīng)56℃水浴滅活30 min。結(jié)果判定：以呈現(xiàn)“++”血凝反應(yīng)的最高稀釋度為該血清的間接血凝抗體效價(jià)。

1.3.2.2 豬瘟阻斷ELISA試驗(yàn) 操作按試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)有效性：陰性對照平均OD(450)>0.5，陽性對照平均阻斷率%≥50。計(jì)算公式：

阻斷率%=100[NCXA(450)-樣品A(450)]/NCXA(450)

結(jié)果判定：

陰性可疑陽性阻斷率%≤3030<阻斷率%<40阻斷率%≥40

1.3.2.3 豬繁殖和呼吸綜合征抗體間接ELISA檢測試驗(yàn) 操作按試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)成立條件：陽性對照的平均值OD450>0.6，而且陽性對照平均值/陰性對照平均值>4.0 IRPC計(jì)算公式：

IRPC=[(OD450樣品-OD450陰性對照平均值)/(OD450陽性對照平均值-OD450陰性對照平均值)]×100

IRPCPRRS抗體說明

小于或者等于20陰性大于20.0陽性

2 結(jié) 果

2.1 豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組豬瘟的免疫，因受PRRSV的免疫抑制干擾的影響，在180日的觀察期內(nèi)，豬瘟平均抗體效價(jià)下降至3 log 及3至1.5 log。而對照組(即PRRSV被控制組)的豬瘟免疫，其豬瘟平均抗體效價(jià)即能從4 log上升至9.5 log，并能長期維持在8.4 log左右。見表1。

表1 PRRSV對豬瘟疫苗的免疫抑制危害

表中效價(jià)為各試驗(yàn)組中的10個樣本平均數(shù)。

PRRSV對豬瘟疫苗的免疫抑制結(jié)果如圖1。

注：豬瘟間接血凝試驗(yàn)的血凝效價(jià)是取以2為底的對數(shù)。圖1 PRRSV對豬瘟疫苗的免疫抑制曲線

2.2 豬瘟阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間試驗(yàn)組的平均合格率為93%，且在180日齡時(shí)仍能維持在100%。而對照組(即PRRSV被控制組)試驗(yàn)期間平均合格率也僅有90%。兩者無明顯區(qū)別(見表2)。

豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)和阻斷ELISA試驗(yàn)反應(yīng)，當(dāng)PRRSV感染豬(試驗(yàn)組)受到免疫抑制下調(diào)抗體水平表現(xiàn)零免疫合格率時(shí)，豬瘟E2蛋白卻仍有高達(dá)90%以上的免疫合格率，而且兩試驗(yàn)組間無明顯差異，從而可證：它有堅(jiān)強(qiáng)的抗免疫抑制能力。

2.3 間接血凝試驗(yàn)與阻斷ELISA的結(jié)果符合率 試驗(yàn)證實(shí)間接血凝試驗(yàn)陽性結(jié)果與阻斷ELISA結(jié)果高度相關(guān)，其符合率在90%以上，但它們的效價(jià)大小卻與阻斷率無關(guān)(見表3、表4 )。

雖然當(dāng)PRRSV感染豬(試驗(yàn)組)受到免疫抑制下調(diào)抗體水平表現(xiàn)零免疫合格率時(shí)，豬瘟E2蛋白抗體陽性率卻為90%，差異極顯著。但對照組的兩試驗(yàn)結(jié)果符合率卻高達(dá)90%。

表2 豬瘟E2蛋白抗體阻斷ELISA試驗(yàn)

表3 豬瘟間接血凝試驗(yàn)與阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果符合率

表4 豬瘟間接血凝效價(jià)高低與E2蛋白抗體阻斷率的相關(guān)性

注：表4序號1～10為試驗(yàn)組；11～20為對照組100日齡仔豬試驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：豬瘟的間接血凝效價(jià)高低與E2蛋白抗體阻斷率的大小與否無關(guān)。

2.4 各試驗(yàn)組的藍(lán)耳抗體檢測結(jié)果 豬藍(lán)耳抗體檢測顯示：試驗(yàn)組豬群PRRSV感染嚴(yán)重，見表5。

表5 PRRSV感染豬與抗感染豬的

以上不難發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對照組的藍(lán)耳抗體陽性率則沒有明顯區(qū)別，如僅以抗體陽性率來評估豬藍(lán)耳疫苗的免疫質(zhì)量，是容易出現(xiàn)較大誤差的。

2.5 豬瘟E2蛋白的遺傳特性 經(jīng)二次豬瘟疫苗免疫后，ELISA結(jié)果不合格者，再多次重免后抽測結(jié)果其阻斷率仍不合格，記錄見表6。

表6 豬瘟E2蛋白免疫耐受試驗(yàn)

3 結(jié)果與討論

3.1 試驗(yàn)顯示 豬瘟免疫抗體效價(jià)，是免疫血清(多克隆抗體)在正向間接血凝試驗(yàn)中的直接反應(yīng)，機(jī)體因受PRRSV免疫抑制的干擾，其豬瘟免疫抗體效價(jià)會下調(diào)至2 log以下。控制PRRSV的感染，能上調(diào)間接血凝效價(jià)的合格率為100%。認(rèn)識其作用機(jī)制對進(jìn)一步做好豬瘟和PRRSV的防疫和凈化工作有著重要的指導(dǎo)意義。

3.2 試驗(yàn)表明 當(dāng)試驗(yàn)組(PRRSV感染組)豬瘟間接血凝試驗(yàn)的群體合格率下降為零時(shí)，豬瘟E2蛋白抗體群體合格率(阻斷率)卻依然在90%以上，且與對照組(PRRSV控制組)ELISA試驗(yàn)的合格率基本一致。由此提示：PRRSV對豬瘟E2蛋白的免疫干擾影響甚微，亦則證明了豬瘟E2蛋白有可靠的抗免疫抑制能力。因此，它可以解釋豬藍(lán)耳病毒能對豬瘟免疫產(chǎn)生抑制干擾，影響了多克隆抗體的血凝效價(jià)，但阻礙不了E2蛋白抗體的產(chǎn)生。

3.3 試驗(yàn)提示 豬瘟間接血凝效價(jià)的高低與E2蛋白抗體阻斷率的大小無關(guān)，但它的陽性結(jié)果則與E2蛋白ELISA試驗(yàn)的合格率高度相關(guān)。由于豬瘟E2蛋白抗體具有堅(jiān)強(qiáng)的抗病毒能力，因此在有PRRSV感染的環(huán)境條件下，僅以間接試驗(yàn)的零合格率來評估豬瘟免疫質(zhì)量肯定是欠科學(xué)的，當(dāng)IHA試驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，再用豬瘟E2蛋白ELISA試驗(yàn)復(fù)核是必要的。雖然豬瘟間接血凝試驗(yàn)的陽性結(jié)果與E2蛋白的阻斷ELISA的結(jié)果有90%以上的符合率，但仍可從試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些個體多次免疫耐受的特質(zhì)，是否有與遺傳因素有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。