徐麗麗 胥方元 萬永鮮

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)主要存在于骨骼系統(tǒng)松質骨中，是一種具有多向分化能力的早期前體細胞，在適當條件刺激下可以分化為骨細胞[1]。基于間充質干細胞的成骨分化能力，因此來源于各種組織的間充質干細胞被視為骨組織工程的重要種子細胞來源。由于BMSCs取材簡單，組織來源較為豐富，逐漸成為了骨缺損、骨軟化病、骨質疏松癥(osteoporosis，OP)等疾病干細胞治療的重要種子細胞[2]。自噬是生物體內一種保守的生命現(xiàn)象，基本的生理學意義在于清除受損的細胞器或蛋白，將其代謝產(chǎn)物重新供能，從而維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[3]。近年來，自噬在細胞和器官分化和發(fā)育過程中的作用備受關注，例如自噬缺乏導致小腦和大腦皮質廣泛的神經(jīng)細胞凋亡和退行性改變[4]；而對于心肌細胞，自噬缺乏容易導致心肌肥厚、心功能不全等[5]；自噬同樣在造血細胞分化成熟過程中扮演著重要角色，抑制自噬可能導致造血干細胞分化成熟障礙，表現(xiàn)為貧血和白細胞減少[6]。在自噬對成骨分化影響方面，國內李軍等[7]利用自噬激動劑雷帕霉素促進BMSCs自噬活性后，其向成骨分化的潛力減弱。但國外研究報道葡萄膜球菌脂磷壁酸可以通過激活自噬來促進小鼠間充質干細胞的成骨分化[8]。

綜上所述，自噬對于間充質干細胞成骨分化的影響并不明確，本實驗研究擬通過比較實驗組骨質疏松與正常對照組BMSCs的成骨分化能力和自噬水平，初步探討自噬對人BMSCs成骨分化的影響，為下一步選擇成骨分化靶點，促進骨形成提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設備廠，中國)，細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，離心機(Beckman-Coulter，美國)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)，超聲細胞破碎儀(Philips，荷蘭)，凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)，激光共聚焦熒光顯微鏡(Hitachi，日本)，核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 實驗試劑

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，PBS緩沖液(Hyclon，美國)，0.25%胰蛋白酶(索萊寶，中國)，成骨誘導培養(yǎng)基(賽業(yè)生物，中國)，RIPA細胞裂解液(碧云天，中國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)，蛋白Marker(碧云天，中國)，SDS-PAGE配膠試劑盒(碧云天，中國)，TBST緩沖液(索萊寶，中國)，PVDF膜(Millipore，美國)，ECL發(fā)光顯影液(Millipore，美國)，LC3小鼠抗人單克隆抗體(Sigma，美國)，P62小鼠抗人單克隆抗體(Abcam，英國)，β-actin兔抗人單克隆抗體(碧云天，中國)，山羊抗小鼠IgG二抗(碧云天，中國)，山羊抗兔Ig二抗(碧云天，中國)，4%多聚甲醛固定液(碧云天，中國)，茜素紅染色試劑盒(Thermo Fisher，美國)，堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天，中國)，LC3-GFP慢病毒(漢恒，中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1BMSCs分離培養(yǎng)：10例椎體松質骨來源于2015年6月至2016年6月在我院接收椎體次全切減壓植骨內固定術的患者。所有患者在術前均簽署了知情同意書，該研究經(jīng)過了我院倫理委員會的批準。根據(jù)年齡分為兩組，A組為老年骨質疏松組：共5例，年齡60～75歲，平均(69.4±7.2)歲，術前骨密度檢測T值<-2.5，診斷為骨質疏松癥，未有過抗骨質疏松治療史；B組為年輕對照組，共5例，年齡26～35歲，平均(30.2±5.4)歲，既往體健，非病理性骨折。

小心分離術中摘取的椎體中央松質骨，用含1%雙抗的PBS反復沖洗、離心3次；用眼科剪將松質骨剪成泥樣，移植入10 cm培養(yǎng)皿中，每一份松質骨的體積約為10 mm×10 mm×10 mm，每塊組織間的距離不超過5 mm，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h；沿培養(yǎng)皿壁小心加入5 mL含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，避免松質骨團塊漂浮，繼續(xù)置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～4 d再添加5 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)觀察；7 d左右通過倒置顯微鏡可以觀察到紡錘樣的單層貼壁細胞，即為人BMSCs，細胞集落邊緣細胞間最先相互融合，當細胞融合至80%以上后行胰酶消化傳代培養(yǎng)；取第1～3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2Western blot檢測：取A組和B組的原代細胞，常規(guī)提取細胞總蛋白，行Western blot檢測自噬相關蛋白LC3和P62，實驗步驟簡述如下：(1)取A組和B組原代細胞加入RIPA裂解液，冰上常規(guī)反應30 min后，超聲細胞震碎儀處理1 min，4 ℃，12 000 g高速離心5 min后取上清即為提取的總蛋白；(2)采用BCA法常規(guī)檢測蛋白濃度，短期內使用的蛋白以1∶4混合5×SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min后放置于-20 ℃保存；(3)采用SDS-PAGE配膠試劑盒，根據(jù)目標蛋白分子量大小，配置相應的凝膠濃度；(4)上樣，每孔以相同蛋白量50 μg恒壓(100 V)跑膠1～2 h，待溴酚藍進入分離膠底部后電泳結束；(5)采用濕轉法將膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件250 mA恒流轉30 min～1 h；(6)5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入對應合適濃度的一抗，4 ℃孵育過夜；(7)復溫半小時后，TBST緩沖液洗滌 5 min/次×3次，加入對應合適濃度二抗，37 ℃孵育1 h；(8)TBST緩沖液洗滌 5 min/次×3次，加入ECL顯影液曝光，拍照。(9)條帶灰度值采用Quantity one軟件分析。

1.3.3LC3-GPF腺病毒轉染：自噬檢測的金標準為電鏡觀察，但由于電鏡觀察耗時較久，且只能捕捉一個時間橫斷面的細胞狀態(tài)，不利于監(jiān)測細胞自噬狀態(tài)。因此，本實驗采用攜帶LC3-GFP綠色熒光基團的腺病毒轉染BMSCs，觀察自噬的動態(tài)過程，實驗原理如下：自噬沒有被激活時，LC3-GFP融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，其轉位聚集至自噬體膜上，在激光共聚焦熒光顯微鏡下即可觀察到一個個明亮的綠色熒光蛋白，理論上一個綠色熒光斑點即代表一個自噬體，可以通過計數(shù)斑點的數(shù)量來評價自噬活性的高低。腺病毒轉染步驟簡述如下：(1)以1×105/孔細胞密度將原代BMSCs種植于共聚焦培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱孵育過夜；(2)加入1/2體積含有病毒的培養(yǎng)基，以感染復數(shù)30轉染目的細胞，每孔加入病毒懸液2 h后換液；(3)轉染24 h后，現(xiàn)在普通熒光顯微鏡下初步觀察轉染效率，是否可以看到綠色熒光。一般在轉染后36～48 h可以觀察到明顯的熒光顆粒，這時用Dapi染核后在激光共聚焦顯微鏡下觀察、計數(shù)綠色熒光斑點；(4)隨機選取3個不同視野，計數(shù)綠色斑點，然后行統(tǒng)計學分析。

1.3.4成骨誘導培養(yǎng)：(1)成骨誘導分化培養(yǎng)基配置。①使用前將血清置于2 ℃～8℃環(huán)境中解凍過夜至血清完全溶解，輕晃試劑瓶以確保血清充分混均；②配置前30 min，室溫靜置溶解抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、雙抗和谷氨酰胺，輕輕上下顛倒充分混勻；③使用前10 min，室溫靜置溶劑地塞米松；④用70%乙醇擦拭各個試劑瓶開口外壁消毒，靜置待酒精充分揮發(fā)。將抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、成人BMSC專用胎牛血清、雙抗和谷氨酰胺全部加入成人BMSC成骨誘導分化培養(yǎng)基中，最后加入地塞米松；⑤輕晃配置好的完全培養(yǎng)基，充分混勻。(2)成骨誘導培養(yǎng)實驗步驟。①取1～3代BMSCs按照5×104/孔細胞密度種植于事先包被0.1%明膠的六孔板，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基；②將細胞置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；③當細胞融合度達到60%～70%時，小心將孔內的完全培養(yǎng)基移棄，向六孔板中加入2 mL OriCellTM成人BMSC成骨誘導分化完全培養(yǎng)基；④每隔3 d換液一次，誘導3周后進行后續(xù)檢測。

1.3.5茜素紅染色：(1)成骨誘導分化3周后，摒棄成骨誘導培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗2次后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液，室溫靜置30 min；(2)摒棄多聚甲醛溶液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，每孔加入茜素紅染色液，室溫靜置3～5 min；(3)摒棄茜素紅染液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，置于倒置光學顯微鏡下觀察。

1.3.6堿性磷酸酯酶染色：(1)配置堿性磷酸酶染色工作液：參照試劑盒說明，將sodium nitrite soulution、frv-alkaline solution按照1∶1混合，輕輕顛倒混勻，靜置2 min。加入45份比例的雙蒸水，再加入1份比例的naphthol as-bi alkaline solution，充分混勻；(2)成骨誘導分化3周后，摒棄成骨誘導培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗2次后，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定液，室溫靜置30 min；⑶摒棄多聚甲醛溶液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，每孔加入堿性磷酸染色液，室溫靜置3～5 min；⑷摒棄堿性磷酸酶染液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，置于倒置光學顯微鏡下觀察。

1.3.7熒光定量PCR檢測：成骨誘導分化3周后，提取細胞總RNA，采用熒光定量PCR檢測主要的成骨指標I型膠原(collagen type I，Col I)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、發(fā)育不全相關轉錄因子2(runt related transcription factor 2，RUNX2)的mRNA表達差異。實驗步驟簡述如下：(1)預冷PBS緩沖液于冰上30 min，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗5 min/次×3次，每孔加入1 mLRNA提取裂解液(Trizol)，冰上靜置15 min后反復吹打細胞，使其充分裂解；(2)將細胞裂解液移入1.5 mL EP管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩，冰上靜置5 min后高速離心，12 000 g，4℃，離心5 min；(3)取200～400 μL上層水相，移到另一個EP管中，以1∶1加入相同體積異丙醇，輕柔混勻，冰上靜置15 min后高速離心，12 000 g，4℃，離心15 min；(4)移棄上清，可以看到小塊羽絮狀沉淀，即所提取的RNA，用500 μL75%乙醇洗滌RNA沉淀；(5)高速離心12 000 g，4℃，離心5 min，自然風干RNA后加入20 μL DEPC水溶解；(6)用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，可放置于-20 ℃短期保存；(7)采用逆轉錄試劑盒合成cDNA；反應液配置完成后，加入200 μL PCR反應管匯總，置于PCR儀中進行逆轉錄反應，條件如下：37 ℃ 逆轉錄 15 min；85 ℃ 終止滅活逆轉錄酶 5 s；4 ℃ 終止逆轉錄反應；得到的cDNA樣本可以置于-20 ℃短期保存。(8)SYBR Green熒光定量PCR檢測目的基因表達。(9)熒光定量PCR結果采用2- ΔΔCT法統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行分析處理。兩兩比較采用t檢驗，兩組以上比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用post hoc檢測。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 老年骨質疏松BMSCs自噬水平降低

為了比較來源于老年骨質疏松患者和正常年輕患者BMSCs的基礎自噬水平，分別取A組和B組的原代細胞，首先通過Western blot檢測比較自噬相關蛋白LC3和P62的表達。自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-I)會酶解一小段多肽，轉變?yōu)樽允审w膜型(即LC3-II)，因此可以通過LC3-II/I比值來判斷自噬的激活程度。而P62是自噬的降解底物，在自噬形成時與自噬體膜上的LC3相結合，繼而被自噬體所降解，因此P62表達高低與自噬活躍程度呈反比。結果表明，A組BMSCs的LC3-II/I表達比率比B組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而P62的蛋白表達在A組BMSCs中卻明顯升高，與B組相比差異同樣具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測自噬相關蛋白LC3和P62Fig.1 Western blot detection of autophagy related proteins LC3 and P62

由于LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，容易造成假陽性，因此為了更加客觀地評判自噬水平的高低，本實驗采用LC3-GFP融合蛋白轉染來示蹤自噬體形成。激光共聚焦顯微鏡下顯示A組平均每個細胞中綠色熒光斑點數(shù)目明顯小于B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

綜上，初步判斷老年骨質疏松BMSCs中的基礎自噬水平較年輕正常BMSCs中明顯降低。

2.2 老年骨質疏松BMSCs成骨分化能力減弱

為了探究BMSCs的自噬水平是否與成骨能力相關，探討比較老年骨質疏松患者和正常年輕患者BMSCs的成骨分化能力。圖3顯示在成骨誘導分化3周后，A、B兩組茜素紅染色均顯示紅染鈣結節(jié)，但鈣化結節(jié)數(shù)A組明顯少于B組；堿性磷酸酶染色結果相似，兩組均有堿性磷酸酶染色陽性細胞，但A組陽性細胞數(shù)及染色陽性程度均弱于B組。

為了更加定量比較兩者成骨分化差異，采用熒光定量PCR檢測主要成骨相關蛋白的mRNA表達。結果顯示I型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、RUNX2等4個主要指標的mRNA在A組均明顯少于B組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 不同組別成骨誘導培養(yǎng)基刺激3周后的染色結果。A：茜素紅染色，B：堿性磷酸酶染色Fig.3 Results of staining after 3 weeks of osteogenic induction medium stimulation in different groups. A: Alizarin red staining, B: Alkaline phosphatase staining.

圖4 熒光定量PCR檢測成骨相關基因I型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、RUNX2等Mrna表達Fig.4 Detection of Mrna expression of osteogenic related genes including collagen type I, osteocalcin, osteopontin and RUNX2 by fluorescence quantitative PCR

上述研究結果表明老年骨質疏松BMSCs成骨誘導分化能力較弱，顯示了在BMSCs中較低的自噬水平表現(xiàn)出較弱的成骨分化能力。

3 討論

成骨能力降低是導致老年性OP的主要病因，但如何提高老年患者的成骨分化能力目前仍是一個研究熱點[9]。BMSCs作為一種具有多向分化潛能的前體細胞，相對其他組織干細胞而言，具有取材豐富，提取簡便的優(yōu)勢。

自噬是細胞適應外界應激的主動生理調控機制，近年來自噬在骨形成中的作用才逐漸被發(fā)現(xiàn)[10]。Nuschke等[11]研究表明在成骨分化的早期，人間充質干細胞內的自噬水平會明顯提高，而當分化為成熟骨細胞后自噬又會明顯下降，提示自噬在成骨分中扮演了重要作用。更進一步的研究表明，自噬可以通過調控NF-κB[12]和TNFSF11/RANKL[13]兩條信號通路，促進成骨分化、提高礦化能力，從而有利于骨形成。而在體內研究中同樣發(fā)現(xiàn)橈骨遠端的骨密度與自噬水平密切相關[14]。但國內有研究表明當上調BMSCs自噬活性后，其向成骨分化的潛力減弱[7]。由此可見，當前自噬與成骨分化的關系并不明確，分析其原因可能與所選用種子細胞的差異，以及成骨分化的同階段有關，所以本實驗的目的是通過比較骨質疏松和正常對照的原代BMSCs自噬和成骨分化能力，初步判斷在BMSCs中自噬與成骨能力間的關系。

本實驗結果無論是Western blot還是激光共聚焦觀察均顯示OP組中的BMSCs自噬水平顯著低于正常對照組，而通過組織學染色比較以及熒光定量PCR結果則提示OP組的成骨分化能力同樣較弱。這些結果均提示在BMSCs自噬水平似乎與成骨分化能力呈正相關。

本實驗研究同樣存在一些局限性，首先該研究只是一個觀察性研究，自噬對成骨分化的影響需要進一步驗證；其次在所檢測的幾個成骨指標中，I型膠原屬于早期成骨指標，骨鈣素屬于中期成骨指標，而骨橋蛋白屬于晚期成骨指標[15]，在以后的實驗中可以通過不同時間的成骨誘導，比較不同的成骨指標，使實驗結果更為客觀、可靠。