陶 麗 劉延慶

（1.揚州大學醫(yī)學院，江蘇揚州 225001； 2.國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇揚州 225001）

化療是目前治療癌癥最有效的手段之一，但針對腫瘤耐藥后出現的疾病進展，臨床尚無替代性的良策，給癌癥治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。中醫(yī)藥以其獨特的診療理論和方法在抗腫瘤治療方面顯示出巨大潛力。雷公藤是臨床最為有效且運用最為廣泛的中藥之一，但其治療窗較窄，課題組很早開始關注與雷公藤具有一定親緣性的，功效接近的，但毒性相對溫和的中藥南蛇藤。南蛇藤（Celastrus orbiculatusThunb.）為衛(wèi)矛科植物南蛇藤的藤莖，始載于清代《植物名實圖考》，又名過山楓，具有祛風除濕、通經止痛、活血解毒等傳統功效。課題組前期發(fā)現南蛇藤乙酸乙酯提取物是其體內外抗腫瘤與抗類風濕性關節(jié)炎活性的有效部位[1-4]。進一步通過活性追蹤、化學分離與結構鑒定，課題組從該部位富集獲得以五環(huán)三萜為主的南蛇藤多萜（the total terpenoids ofCelastrus orbiculatusThunb.，TTC）[5]。本研究觀察了TTC對臨床一線化療藥物的體外增效作用，并采用定量藥理學模型進行評價，為南蛇藤在腫瘤治療方面的進一步開發(fā)利用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 細胞株 A549與H1299人非小細胞肺癌細胞株，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 藥物 南蛇藤多萜：南蛇藤購自廣州致信藥業(yè)，經中國藥科大學中藥資源研究室秦民堅教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤的藤莖。取南蛇藤莖藥材10kg，加6倍量90%乙醇，浸泡1h，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏（0.9kg），加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離乙酸乙酯層，加20%乙醇洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮干燥，獲得南蛇藤多萜總部位220g。以乙酰齊墩果酸進行含量測定，其中獲得二萜、三萜含量達71.2%（TTC制備工藝已獲授權發(fā)明專利：200710025343.3）。TTC儲存于4℃冰箱，臨用前用DMSO溶解成100mg/mL的儲液，用不含酚紅的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基稀釋成實驗濃度。紫杉醇注射液（福王）：購自揚子江藥業(yè)集團有限公司。注射用鹽酸吉西他濱（澤菲）：購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司。注射用奧沙利鉑（艾恒）：購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。氟尿嘧啶注射液：購自天津金耀氨基酸有限公司。以上4種化療藥物用PBS稀釋成100mg/mL的儲液。

1.3 主要儀器與試劑 精密天平，純水儀，倒置顯微鏡（Olympus，日本），EnspireTM多模式微孔板檢測系統（PerkinElmer，美國），96孔細胞培養(yǎng)板（Nunc，美國），RPMI-1640培 養(yǎng) 基 與FBS（Gibco，美國），二甲基亞砜（DMSO）與3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT購自美國Sigma公司）。

2 實驗方法

2.1 MTT法測定TTC單獨或與化療藥物聯合用藥的細胞毒作用 將A549、H1299細胞以每孔1×104個細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板內，加入不同濃度TTC（12.5，25，50，100，200μg/mL）或化療藥物（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）或溶劑對照（DMSO），或分別聯合使用TTC與各化療藥物，處理48h后，每孔加入5mg/mL的MTT試劑20μL，37℃孵育4h后，小心吸棄上清，加入150μL/well DSMO溶解，酶標儀測定490nm吸光度，并計算相對細胞活力。

2.2 Combenefit定量藥理學軟件評價TTC與化療藥物的聯用效果 采用英國癌癥研究中心劍橋研究所開發(fā)的Combenefit定量藥理學軟件及Loewe相加模型評價2種化合物組合后潛在的藥物相互作用[6]。測試時，2種藥物的5種梯度濃度包括溶劑對照孔以矩陣模式混合。通過MTT測定每孔細胞的相對增長率所得響應值通過Combenefit軟件使用以生成劑量-效應（D-R）響應矩陣以及協同分布矩陣，并導出可視化結果。

3 實驗結果

3.1 TTC與4種化療藥物聯合用藥劑量確定 為了確定聯合用藥采用的劑量范圍，實驗首先研究了TTC與4種化療藥物單獨使用對A549與H1299兩種非小細胞肺癌細胞株的生長抑制活性，并采用作圖軟件GraphPad自帶的Logistic非線性回歸方程擬合量效關系曲線。結果發(fā)現TTC與4種化療藥物處理細胞48h后分別在12.5～200μg/mL與0.01～100μg/mL劑量范圍內呈現典型的劑量依賴關系，其半數抑制濃度IC50值也基本分布在試驗劑量范圍的中間，此時IC50數據計算相對精確（見圖1）。因此，在聯合用藥時，采用低于TTC自身IC50劑量（3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL）與較寬范圍的化療藥物給藥劑量（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）進行聯合給藥，觀察低劑量TTC與化療藥物是否存在增敏作用，以及所增敏的化療藥物的劑量區(qū)間。

圖1 TTC與4種化療藥物單獨給藥對非小細胞肺癌細胞株體外增殖的影響

圖2 TTC與4種化療藥物聯合給藥對A549（A）與H1299（B）細胞體外增殖的影響

3.2 TTC與4種化療藥物聯合用藥效果分析 聯合用藥時，將5個梯度TTC劑量（3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL）與5個梯度化療藥物（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）連同溶劑對照（即0μg/mL）以矩陣混合的方式進行給藥，因此共產生36種劑量組合。從Combenefit軟件生成的兩株細胞對聯合用藥的響應矩陣圖可以看出，聯合用藥的量效關系呈現對角線分布（見圖2）。Loewe相加定量藥理學藥物相互作用擬合的結果發(fā)現，TTC與4種化療藥物均能產生一定的協同作用。其中，TTC在接近IC50劑量（25～50μg/mL）下與高劑量（10～100μg/mL）的氟尿嘧啶產生協同，而在低于IC50劑量（3.125～25μg/mL）下與低劑量（0.01～10μg/mL）的吉西他濱、奧沙利鉑、紫杉醇產生一定的協同（見圖2）。因此針對后3種化療藥物，在采用低劑量的TTC對其產生增敏作用時，還允許使用更低的化療藥物劑量。

4 討論

課題組前期針對多種消化道腫瘤充分證實南蛇藤提取物體內抗腫瘤作用的有效性和初步的安全性[1-3]，因此明確南蛇藤未來在腫瘤治療中的臨床定位及能夠體現其作用特點的應用價值對南蛇藤開發(fā)利用具有重要意義。我們注意到，臨床上腫瘤患者首次接觸化療藥物無效（固有性耐藥）或者接受化療一段時間內有效但再次進展時（繼發(fā)性耐藥）通常不再接受相同藥物治療且無法采取進一步可行性措施，此時若繼續(xù)給予化療藥物治療，同時給予中藥治療，可以重新獲得化療療效，即所謂的腫瘤復敏（re-sensitization）[7]。這為腫瘤耐藥患者的后續(xù)治療生存帶來一縷曙光，也為中藥抗腫瘤治療提供新的契機。

為了評價南蛇藤多萜能否對現代常規(guī)化療產生潛在的增效作用，本實驗采用3D可視化的定量藥理學計算軟件篩選南蛇藤多萜與化療藥物的聯合效應。結果發(fā)現TTC能在低于其IC50劑量下增強多種一線化療藥物的敏感性，因此在廣譜性的化療增敏劑方面有較為廣闊的應用前景?？紤]TTC本身具有一定的抗腫瘤活性，因此其化療增敏作用有可能來源于作用機制上的互補性。Combenefit軟件中的Loewe相加模型引入等效劑量的概念，建立了用等效線方法判斷藥物相互作用的指標，將藥物相互作用進行定量化[8]。利用該軟件Loewe相加模型評價并以熱圖方式呈現TTC與四種化療藥物的相互作用，我們發(fā)現這種相互作用在不同的細胞株中的效應分布基本一致，特別是兩種藥物分別在低劑量下聯用產生大于同等劑量的藥理效應，即TTC對低于治療量的化療藥物產生增敏作用。

在今后的工作中，我們將進一步建立符合臨床耐藥進展特點的耐藥模型，在此基礎上考察TTC能否實時性增強化療藥物的敏感性甚至逆轉耐藥模型并達到最初的敏感性，從而為南蛇藤作為腫瘤復敏的中藥新藥開發(fā)夯實臨床前數據。